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Percoll是一種適用性廣且操作靈活簡單的低密度梯度分離液,，可用來分離細胞,，亞細胞顆粒，細菌,，病毒,，甚至實現(xiàn)受損細胞及其碎片與完整活細胞的分離。Percoll主要由表面包被單層乙烯吡咯烷酮（PVP）的硅膠顆粒組成,，直徑15-30 nm,，游離PVP的含量僅占1-2%。由于顆粒大小的異質(zhì)化,，離心過程以不同的速率沉淀,，自發(fā)產(chǎn)生一個勻質(zhì)化且等滲的梯度，密度在1.0-1.3 g/ml之間,。大部分沉淀系數(shù)＞60S的生物顆粒都可以用實現(xiàn)分離,。

本品是無菌的溶液，呈無色至淺黃色,，具有以下幾大特點,，

1. 形成的梯度密度范圍在1.0-1.3 g/ml之間，整個梯度體系都是等滲的,；
2. 無細胞毒性,，化學(xué)惰性,，不會粘附到細胞膜上；
3. 可調(diào)節(jié)至生理離子強度和pH,；
4. 溫和條件分離細胞,，亞細胞顆粒和較大病毒（低至~70S），可保持其活力和形態(tài)完整性,；
5. 只需角轉(zhuǎn)頭中速離心即可實現(xiàn)預(yù)成梯度或者自發(fā)形成梯度分離,；
6. 粘度低（10±5 cP at 20°C），能夠快速形成梯度和顆粒分離,；采用預(yù)制梯度分離低速離心力（200-1000 × g）僅需數(shù)分至數(shù)十分鐘即可達到滿意的分離結(jié)果,；
7. 穩(wěn)定性高，未開封的產(chǎn)品室溫保存5年有效,；開封的產(chǎn)品室溫?zé)o菌保存至少2年有效,；
8. （未稀釋）可重新高壓滅菌，120°C,，30min,；

使用方法

1. 不同濃度（密度）溶液的制備

注意：稀釋于緩沖液，生理鹽水或0.25 M 蔗糖溶液中,。細胞樣本可用緩沖液如PBS來進行梯度分離,；而亞細胞顆粒，有可能會在鹽離子存在的情況下聚集在一起,，建議使用蔗糖溶液（終濃度0.25 M）來進行梯度分離,。

1. 等滲溶液（SIP）的制備

也就是將未稀釋的原液調(diào)整到等滲透于生理鹽溶液。取9份（v/v）加入1份1.5 M NaCl,，10×濃縮培養(yǎng)基，1.5 M PBS或2.5 M 蔗糖溶液混勻即可,?？赏ㄟ^加入鹽離子或者蒸餾水來調(diào)整滲透壓到zui后需要的值。細胞密度取決于滲透壓,，因此,，SIP溶液的滲透壓常規(guī)來說需要用滲壓計來調(diào)整以確保實驗間結(jié)果的可重復(fù)性。通過以下公式來計算SIP溶液的密度,，

此公式中,，V_x= volume of diluting medium (ml)；V₀= volume of undiluted (ml)

ρ₀= density of (1.130+0.005g/ml),；

ρ₁₀= density of 1.5M NaCl=1.058g/ml(minor differences for other salts),；

        density of 2.5M sucrose=1.316g/ml(minor differences for other additives)

ρ_i= density of SIP solution produced(g/ml)

Thus, for SIP in saline, ρ_i=1.123g/ml and for SIP in sucrose, ρ_i=1.149g/ml, assuming ρ₀=1.130g/ml.

2）稀釋SIP溶液至更低密度

直接使用0.15 M NaCl或1×細胞培養(yǎng)液（正常滲透壓）稀釋SIP到需要的密度，用于細胞分離,；直接使用0.25 M 蔗糖溶液稀釋SIP用于亞細胞或者病毒分離,。通過以下公式來計算調(diào)整SIP到需要的密度,，

此公式中，V_y= volume of diluting medium in ml; V_i= volume of SIP in ml;

ρ_i= density of SIP in g/ml; ρ = density of diluted solution produced in g/ml;

ρ_y= density of diluting medium in g/ml

    (density of 0.15M NaCl is～1.0046g/ml)

    (density of 0.25M sucrose is～1.032g/ml)

例如：To dilute 55ml of SIP to a final density of 1.07g/ml,determine the amount of 0.15M NaCl required.

Volume of 0.15 M NaCl required =55×            =44.6 ml

注意：以上公式調(diào)整得到的實際密度僅僅與預(yù)定密度非常接近,，并不能保證*相同,。因為加入體積和稀釋液密度的微小變化都會影響zui終結(jié)果。要想知道實際密度,，建議使用密度計或折射儀來測定,。

1. 一步法稀釋到需要密度（可選）

根據(jù)以下方法直接將原液稀釋到已知密度的工作液。在量筒內(nèi),，加入1.5 M NaCl或2.5 M 蔗糖到1/10終體積溶液,，然后用蒸餾水稀釋到zui終體積量。根據(jù)以下公式計算需要的原液的體積,，

此公式中,，V₀= volume of undiluted (ml); V= volume of final working solution (ml);

ρ₀= density of (undiluted) (g/ml);  ρ= desired density of final solution (g/ml)

ρ₁₀= density of 1.5M NaCl=1.058g/ml (minor differences for other salts)

        density of 2.5M sucrose=1.316g/ml (minor differences for other additives)

例如：To prepare 100 ml of working solution of of density 1.07g/ml in 0.15M NaCl. To 10 ml of 1.5 M NaCl, add

Volume of required =100×                =49.4 ml (if percoll density is 1.130 g/ml)

and make up to 100 ml with distilled water.

注意：以上公式調(diào)整得到的實際密度僅僅與預(yù)定密度非常接近，并不能保證*相同,。因為加入體積和稀釋液密度的微小變化都會影響zui終結(jié)果,。要想知道實際密度，建議使用密度計或折射儀來測定,。

1. 不連續(xù)（Discontinuous）密度梯度的制備

1） 根據(jù)以上公式將SIP溶液稀釋到需要的一系列不同密度,；

2） 先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清,，這種預(yù)處理可使逐層疊加的液平穩(wěn)沿管壁流下,，使形成滿意的界面。使用槍頭或者寬口針頭的注射器按照高密度向低密度逐層放置的先后順序,，緊貼管壁,，任液體自然慢慢流下，確保上層溶液不會濺入下層或者混入分界處,。

1. 裝樣：樣品體積和細胞濃度根據(jù)不同細胞而異,，一般加樣體積不宜過大，細胞濃度也不可過高,，否則會影響細胞的分離和回收,。
2. 離心：一般采用離心力為400 × g，時間20～25min,。由于多層之間密度差別不大,，因此離心機加速、降速時要慢,，要平穩(wěn),。

1. 取樣：當(dāng)所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除液后收集界面部位的細胞;有時大部分細胞位于層中,，則需要逐層收集,。
2. 清洗：由于沒有細胞毒性,，且不會粘附在細胞膜上，通常來說沒有必要去除,。細胞可直接轉(zhuǎn)入培養(yǎng)體系,，病毒可直接進行感染，細胞器可直接用于代謝功能研究等,。也可以根據(jù)以下方法來進行清洗,，去除percoll。

1）細胞樣本的低速清洗

收獲含有液的活細胞層,，用生理鹽水或者PBS緩沖液按照5:1的體積比清洗2~3次,，每次用200 × g離心2-10 min回收細胞；

1. 病毒或者亞細胞的高速清洗

病毒或者亞細胞由于太小難以用低速離心收集獲得,，可在吊籃式轉(zhuǎn)頭或角轉(zhuǎn)頭離心機中高速離心分離這些樣本,。收獲含有液的分離層放入離心管內(nèi)，以吊籃式轉(zhuǎn)頭100,000×g,，2 h或者角轉(zhuǎn)頭100,000×g,，90 min的條件離心沉淀顆粒。需要的生物樣本保留在上層溶液,。

分離純化細胞舉例

1. 富含NK活性大顆粒淋巴細胞（LGL）的純化：按順序由下向上逐層加50%,、47.5%、45%,、42.5%和40%五種不同密度的,，如用10ml試管(或塑料管)分離，每層約1.2～1.5ml,，初步從外周血中分離的PBMC細胞1×10⁸懸于1ml培基中,，按要求裝樣、離心和取樣,。一般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5%與45%界面以及上下二層的液中,。
2. 純化淋巴母細胞和除去死細胞：分別疊加50%和30%液。收取經(jīng)PHA(或其它抗原,、有絲分裂原)刺激PBMC，或含有較高比例異型的PBMC（如腎綜合征出血熱患者）,，按要求裝樣,、離心和取樣。位于管底的淋巴細胞為小淋巴細胞,；兩層之間為淋巴母細胞,，純度和回收率在80%以上，位于30%表面是死細胞,。收獲淋巴母細胞可進行表型,、結(jié)構(gòu)以及功能的研究,。

人不同血細胞的漂浮密度

運輸與保存方法

室溫運輸。未開封前4-30℃保存,，有效期5年,。開封后于無菌條件2-8℃保存。若以非無菌的條件保存,，產(chǎn)品要凍存在-20℃（需要預(yù)留足夠的膨脹空隙）以防止微生物生長,，zui長6個月穩(wěn)定?？赡軆龃娴?/span>溶液再次融化后會形成梯度,，需要在使用前充分混勻。

注意事項

1. 分離推薦使用聚碳酸酯（PC）離心管,；離心后常有二氧化硅顆粒聚集在管底,，或者分層時聚集在管壁上。干燥后這些沉淀較難去除,，因此建議使用后立即用水沖洗所用設(shè)備,。
2. 在pH 5.5-10之間性能不受任何干擾。但低于pH 5.5會發(fā)生膠凝,。二價陽離子也會引起膠凝,，而溫度升高會加劇此現(xiàn)象發(fā)生。
3. 只有不含鹽離子或蔗糖的（原液）才能高壓滅菌,。因為鹽離子會引起膠凝,，而蔗糖會引起焦糖化。高壓滅菌過程盡量減少與空氣接觸,，避免在percoll/空氣層間形成固體顆粒,，可通過將percoll裝在窄口瓶內(nèi)來避免。如果顆粒已經(jīng)形成,，通過過濾或者低速離心的方式去除,。滅菌后溶液的損失可加入相應(yīng)體積的蒸餾水補足，密度不會受影響,。不可用濾膜除菌,。
4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。