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細(xì)胞示蹤探針專題

• 線粒體探針

線粒體是一種存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中的由兩層膜包被的細(xì)胞器,，直徑在0.5-10微米左右,。線粒體有“細(xì)胞動(dòng)力工廠"之稱，是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要場所,，主要為細(xì)胞活動(dòng)提供能量。另外,，線粒體還承擔(dān)了許多其他生理功能,，如調(diào)節(jié)膜電位并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體膜通透性增加也能使誘導(dǎo)凋亡因子(AIF)等分子釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì),，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),。

1.MitoTracker? 線粒體示蹤

MitoTracker系列探針于檢測活細(xì)胞線粒體，具有細(xì)胞通透性,，易于在有活性的線粒體中積累,。一旦線粒體被標(biāo)記，細(xì)胞就能用甲醛固定劑固定,，一些MitoTracker探針能在固定之后保留在線粒體內(nèi),。盡管傳統(tǒng)的線粒體探針如Rhodamine 123也很容易標(biāo)記線粒體，但是一旦線粒體的膜電位損失,，它們就很容易被洗掉,。

MitoTracker系列探針具有多種顏色，適合于多色標(biāo)記實(shí)驗(yàn),。MitoTracker Green FM 是線粒體綠色熒光染料,，這種染料定位于線粒體的能力看起來不受線粒體膜電位影響。 該染料可以對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色,，但是乙醛固定后不能穩(wěn)定保存,。 MitoTracker Red CMXRos 是一種紅色熒光染料，用于對(duì)活細(xì)胞線粒體進(jìn)行染色,，并且該染料的積累取決于膜電位,。 乙醛固定后，該染料可穩(wěn)定保存,。MitoTracker Red CM-H₂XRos 是 MitoTracker Red 的非熒光還原態(tài),，在氧化時(shí)才會(huì)發(fā)出紅色熒光,。該染料也可以對(duì)活細(xì)胞線粒體進(jìn)行染色并且其積累取決于膜電位。 乙醛固定后,，該染料可穩(wěn)定保存,。但是，該染料在體外發(fā)生氧化反應(yīng),，就不能檢測到熒光,，所以要求保存在惰性（如氮?dú)猓怏w中。MitoTracker? Deep Red FM 是一種遠(yuǎn)紅熒光染料（Ex/Em約為 640/662 nm）,，用于對(duì)活細(xì)胞線粒體進(jìn)行染色,，并且該染料的積累取決于膜電位。 乙醛固定后,，該染料可穩(wěn)定保存,。

2.早期凋亡檢測（線粒體膜電位檢測探針）

在細(xì)胞凋亡的過程中往往伴隨著線粒體跨膜電位的破壞，這被廣泛認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中zui早發(fā)生的事件之一,。它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮,、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰,，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn),。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如 Rhodamine 123,、JC-1,、JC-10等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低,。

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm 的理想熒光探針,，表現(xiàn)出電勢依賴性的積聚在線粒體內(nèi)。正常線粒體內(nèi),，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物,，聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；而凋亡細(xì)胞,，線粒體跨膜電位去極化,，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，濃度降低,，逆轉(zhuǎn)為發(fā)射綠色熒光的單體形式,。因此顏色的變化非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。線粒體的去極化程度也可以通過紅/綠熒光強(qiáng)度的比例來衡量,。JC-1的流式檢測是比較常見的一種方法,。

3.線粒體與活性氧檢測

活性氧，Reactive Oxygen Species（ROS）包括3種含氧的自由基：羥自由基(·OH),，超氧陰離子(O₂·),，氫過氧自由基（HO₂）,；2種過氧化物：過氧化氫(H₂O₂)和過氧化脂質(zhì)（ROOH）；以及一種含氮的氧化物（NO）,。

活性氧（ROS）在通路中的作用：

1）建立宿主自身防御系統(tǒng),，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞生長和分化,，有利于干細(xì)胞增殖,、神經(jīng)保護(hù)等；

2）濃度過高會(huì)引起細(xì)胞凋亡,，細(xì)胞損傷,，脂質(zhì)和蛋白過氧化等。

活性氧（ROS）的主要來源：

1）線粒體的氧化呼吸鏈,；2）NADP氧化酶,；3）細(xì)胞色素P-450。

驗(yàn)證ROS是否來自線粒體的方法?

當(dāng)線粒體產(chǎn)生過量ROS的時(shí)候,，必然導(dǎo)致線粒體本身的正常結(jié)構(gòu)和物理狀態(tài)發(fā)生變化，常見的比如線粒體膜完整性和膜電位的缺失,。

（一）Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit 活性氧（ROS）檢測試劑盒

活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一種基于熒光染料DCFH-DA（2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate）的熒光強(qiáng)度變化,，定量檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的zui常用方法。

DCFH-DA本身沒有熒光,，可以自由穿過細(xì)胞膜,。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH,。而DCFH不會(huì)通透細(xì)胞膜,，因此探針很容易被積聚在細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧能夠氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF,。綠色熒光強(qiáng)度與活性氧的水平成正比,。在zui大激發(fā)波長480nm，zui大發(fā)射波長525nm處,，使用熒光顯微鏡,，流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡等檢測熒光信號(hào)，并根據(jù)陽性對(duì)照Rosup的熒光信號(hào)來分析活性氧的真正水平,。關(guān)于不同細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑盒的比較和選擇關(guān)于不同細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑盒的比較和選擇,，請(qǐng)參考

（二）CellROX Orange Reagent, for Live Cell Oxidative Stress Detection氧化應(yīng)激檢測橙色探針（活細(xì)胞）

CellROX Orange氧化應(yīng)激試劑是能夠可靠地檢測活細(xì)胞中的ROS的熒光探針。細(xì)胞滲透性CellROX試劑一旦氧化,，即可發(fā)出明亮熒光,。CellROX Orange試劑熒光信號(hào)主要位于胞質(zhì)。

采用傳統(tǒng)的熒光顯微鏡,、高內(nèi)涵成像和分析,、微孔板熒光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀測量產(chǎn)生的熒光,。染色操作過程極為簡單，可將試劑直接加入*培養(yǎng)基或緩沖液中的細(xì)胞,。與傳統(tǒng)的ROS檢測染料相比,，CellROX試劑的光穩(wěn)定性極強(qiáng)。

產(chǎn)品特點(diǎn)

A適用于熒光成像,、熒光酶標(biāo)儀,、流式細(xì)胞術(shù)和高內(nèi)涵篩選；

B對(duì)光漂白作用具有較強(qiáng)的抵抗力,；

C多重分析：可與不同熒光素染料相兼容,；

D功能多樣：適用于活細(xì)胞成像或固定樣本。

（三）MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator 線粒體超氧化物紅色熒光探針

MitoSOX Red是活細(xì)胞中的一種特異性靶向線粒體的新型熒光染料,。 MitoSOX Red被超氧化物而非其他活性氧類(ROS)和活性氮類(RNS)氧化,，氧化產(chǎn)物結(jié)合核酸后產(chǎn)生大量紅色熒光，線粒體產(chǎn)生的超氧化物可在熒光顯微鏡下顯示,。MitoSOX Red可用于在對(duì)活細(xì)胞線粒體釋放的超氧化物的直接檢測中區(qū)別分離線粒體中的人為誤差,。

產(chǎn)品特點(diǎn)

A容易為超氧化物而不是其他的ROS、RNS生成系統(tǒng)氧化,；

B吸收波長?發(fā)射波長zui大值: ~510?580 nm,；

C用于活細(xì)胞成像；

D快速選擇性靶向線粒體,；

E快速簡便檢測活細(xì)胞線粒體中的超氧化物,。

4.線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）分析

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeablity transition pore,，mPTP）,，又稱線粒體巨型通道（magachannel），是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的非選擇性高導(dǎo)電性通道,，由多種蛋白質(zhì)復(fù)合組成,。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔 (mPTP)可能參與了細(xì)胞死亡過程中線粒體成分的釋放。 相對(duì)于僅基于線粒體膜電位的分析來說,，該分析試劑盒能更直接地檢測線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放,。

5.線粒體定位載體

線粒體定位載體用于研究重組蛋白在線粒體（mitochondria）的定位及功能的便利的工具。研究人員可以根據(jù)自己的研究目的選擇相應(yīng)的定位表達(dá)載體,，再將感興趣的ORF片段構(gòu)建到表達(dá)載體中進(jìn)行研究,。 

陽性對(duì)照可以表達(dá)GFP，且同樣定位在線粒體上,。

細(xì)胞定位載體具有以下特點(diǎn)：

1）CMV強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)蛋白的表達(dá),；

2）C端攜帶c-myc標(biāo)簽，可用anti-myc抗體檢測,；

3）BGH多腺苷酸化位點(diǎn)可以穩(wěn)定mRNA,；

4）f1原點(diǎn)單鏈正義鏈DNA f1 origin for single-stranded rescue of sense DNA

5）攜帶Neomycin抗性基因可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選,；

6）Ampicillin抗性和pUC原點(diǎn)可用于E. coli中的篩選；

7）載體帶的熒光標(biāo)記可通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察,；

8）應(yīng)用于研究蛋白在微環(huán)境中的檢測,。

細(xì)胞定位是指某種蛋白或表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中的具體存在位置，例如在細(xì)胞核（ nucleus）內(nèi),、細(xì)胞質(zhì)（ cytoplasm）內(nèi),、線粒體（mitochondria）或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum）上。

• LysoTracker和Lysosensor溶酶體探針

溶酶體為單層膜蛋白包圍的內(nèi)含一系列酸性水解酶的小體,。溶酶體中含有多種酶，如糖苷酶,、酸性磷酸酶,、彈性蛋白酶、組織蛋白酶等等,，是物質(zhì)代謝的場所,。Lysotracker系列探針用于標(biāo)記和追蹤活細(xì)胞中的酸性細(xì)胞器，該系列探針對(duì)酸性細(xì)胞器具有很高的選擇性,，且標(biāo)記效率高（納摩爾濃度即可有效標(biāo)記）,。Lysotracker探針是細(xì)胞膜通透性的，一般聚集在球形的細(xì)胞器中,。

LysoSensor系列探針可用于活細(xì)胞中溶酶體生物發(fā)生動(dòng)力學(xué)研究，該探針是向酸性的探針,，由于質(zhì)子化作用聚集在酸性細(xì)胞器中,。質(zhì)子化也緩解了染料的熒光淬滅，使熒光強(qiáng)度增加,。因此,，LysoSensor探針在酸化的環(huán)境中表現(xiàn)出pH依賴的熒光強(qiáng)度增加，而LysoTracker的熒光則沒有明顯變化,。LysoSensor? Green DND-189的pKa值很低,，處于酸性環(huán)境中才會(huì)發(fā)出熒光。LysoSensor? Yellow/Blue DND-160很特別,，具有雙激發(fā)和雙發(fā)射峰,，是pH依賴的。在酸性細(xì)胞器中,，它主要發(fā)黃色熒光,，而在弱酸性細(xì)胞器中，熒光則為藍(lán)色,。

注：探針標(biāo)記細(xì)胞后,，只能用熒光顯微鏡觀察,，而不能用流式或熒光酶標(biāo)儀檢測,，因?yàn)樵诳偧?xì)胞熒光中溶酶體熒光只占非常小的比例,。

• 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針

1.活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中由膜圍成的分支小管、小囊或扁平囊狀結(jié)構(gòu)連通而成的管道系統(tǒng),，可分為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩種,。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上附著有核糖體,，是合成蛋白質(zhì)的主要場所；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則功能多樣,，比如在肝細(xì)胞中與解毒和糖代謝有關(guān),。ER-Tracker系列探針是細(xì)胞通透性的活細(xì)胞染料，是ER高度選擇性的,。ER-Tracker Blue-White DPX 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)藍(lán)色熒光探針,，染色后可用醛類固定，但熒光信號(hào)會(huì)又明顯損失【信號(hào)部分保留】,。ER-Tracker Green (BODIPY? FL Glibenclamide) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)綠色熒光探針,，染色后可用醛類固定，但熒光信號(hào)會(huì)又明顯損失【信號(hào)部分保留】,。ER-Tracker Red (BODIPY? TR Glibenclamide)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針染色后可用醛類固定,，但熒光信號(hào)會(huì)又明顯損失【信號(hào)部分保留】。

2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位載體

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位載體用于研究重組蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum）的定位及功能的便利的工具,。研究人員可以根據(jù)自己的研究目的選擇相應(yīng)的定位表達(dá)載體,，再將感興趣的ORF片段構(gòu)建到表達(dá)載體中進(jìn)行研究。 

陽性對(duì)照可以表達(dá)GFP,，且同樣定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,。

• 高爾基體探針

高爾基復(fù)合體的功能主要是將由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)來的蛋白類物質(zhì)進(jìn)行加工,、濃縮,、儲(chǔ)存和運(yùn)送，zui后形成分泌泡排除,。

1.活細(xì)胞高爾基體探針

Golgi-Tracker Green（BODIPY? FL C5-Ceramide）適用于活細(xì)胞高爾基體染色探針,，不適用于固定細(xì)胞染色。

Golgi-Tracker red（BODIPY? TR C5-Ceramide） 適用于活細(xì)胞高爾基體染色探針,，不適用于固定細(xì)胞染色,。

2.高爾基體反面、順面及中間室探針

NBD C6-ceramide呈綠色熒光（Ex=464nm,，Em=532nm）,，是目前應(yīng)用較廣泛的選擇性染色高爾基復(fù)合體的探針。適用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。適用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞內(nèi)反面高爾基體（trans-golgi）染色探針,、中間室及反面高爾基體熒光探針（intermediate-to-trans Golgi）,。

Lectin GS-II是分離自一種非洲豆科類植物Griffonia simplicifolia 的四聚體蛋白，分子量約為113kD,。每個(gè)亞基含有一個(gè)特異的結(jié)合位點(diǎn),，高選擇性結(jié)合糖蛋白的末端非還原性α/β-N-乙酰-D-半乳糖苷(GlcNAc)殘基。與其他凝集素不同,，GS-II不會(huì)與特異的血型反應(yīng),。Lectin GS-II用于檢測多種組織和細(xì)胞中末端N-乙酰-D-半乳糖苷殘基的表達(dá)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,，熒光標(biāo)記的GS-II常用于高爾基體的染色,，標(biāo)記中間室-反式高爾基體，同時(shí)還可以標(biāo)記少突細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的高爾基體,。我們提供3種顏色的熒光標(biāo)記Lectin GS-II,，綠色熒光Alexa Fluor 488 (L21415)，紅色熒光Alexa Fluor 594 (L21416)和遠(yuǎn)紅外熒光Alexa Fluor 647 (L32451),。

Lectin Helix pomatia agglutinin (HPA)是一種六聚體蛋白,，分子量為70kD，選擇性結(jié)合A型紅細(xì)胞及α-N-乙酰半乳糖胺殘基末端,。在某些細(xì)胞中,，熒光標(biāo)記的HPA可以用來標(biāo)記高爾基體的順面扁平膜囊區(qū)。常用的有Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647標(biāo)記的HPA (L11271, L32454),。

• 細(xì)胞質(zhì)膜探針——親脂性膜探針

DiD,，DiO，DiI和DiR染料是一類親脂性的熒光染料,，可以用來染細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu),。進(jìn)入細(xì)胞膜后，染料在整個(gè)細(xì)胞膜上擴(kuò)散,，*濃度時(shí)可以使整個(gè)細(xì)胞膜染色。染料在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱,，當(dāng)與細(xì)胞膜結(jié)合后其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng),，這類染料有著很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命。它們的熒光顏色區(qū)分明顯：DiI(橙色熒光),，DiO(綠色熒光),，DiD(紅色熒光)和 DiR (深紅色熒光)這使得他們可以用來對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行多色成像和流式分析，另外,，DiI (DiIC18(3)) 也可用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜標(biāo)記,。DiI和DiO可以分別用標(biāo)準(zhǔn)的 FITC和TRITC的濾光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激發(fā)，有著比DiI更長的激發(fā)波長和發(fā)射波長,，在細(xì)胞和組織染色中更有價(jià)值,。 DiR的紅外熒光可以穿透細(xì)胞和組織，自熒光背景低,，特別適用于標(biāo)記細(xì)胞和脂質(zhì)體的體內(nèi)追蹤,。

DiA為親脂性氨基苯乙烯基染料，常用于神經(jīng)元的示蹤,。DiA可與DiI雙色標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞,，是一種比DiO更好的示蹤探針。

CellTracker CM-DiI為DiI 的衍生物,，在DiI 中加入了具有中度巰基反應(yīng)特性的氯甲基取代物,，后者能與細(xì)胞內(nèi)含巰基的肽和蛋白結(jié)合，使得CM-DiI 能夠抵抗醛類的固定作用,。CM-DiI 在細(xì)胞固定,、破膜及石蠟包埋的整個(gè)過程中均能很好的保留在細(xì)胞內(nèi)，因此較DiI 更適于固定后標(biāo)本的長期示蹤,?？膳cGFP一起用于雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)。

• 細(xì)胞質(zhì)探針

細(xì)胞質(zhì)由細(xì)胞質(zhì)基質(zhì),、內(nèi)膜系統(tǒng),、細(xì)胞骨架和包涵物組成，在生活狀態(tài)下為透明膠狀物,，是生命活動(dòng)主要場所,。

1.活細(xì)胞探針

Fluorescein diacetate即FDA，中文名為二乙酸熒光素,，是一種具細(xì)胞膜滲透性的酯酶底物,，常用作細(xì)胞活力分析。不僅可以測定酯酶活力,，因FDA需要在酯酶的催化下才能活化產(chǎn)生綠色熒光,；而且還可用來鑒定細(xì)胞膜完整性，只有在完整膜內(nèi)才能維持熒光,。也可用于流式分析,。

鈣黃綠素(Calcein, AM)是一種對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，由于在Calcein(鈣黃綠素)的基礎(chǔ)上加強(qiáng)了疏水性,，因此能夠輕易穿透活細(xì)胞膜,。進(jìn)入細(xì)胞后，Calcein, AM被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Calcein,，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi),，發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類試劑(如BCECF, AM和CFDA)相比，由于Calcein, AM細(xì)胞毒性極低,，是用于活細(xì)胞染色的熒光探針,，而且不會(huì)抑制任何的細(xì)胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性,。Calcein, AM是用于檢測細(xì)胞粘附,、趨化性和多藥抗藥性的的探針。

CellTracker系列產(chǎn)品（包括CellTracker Orange, CellTracker Green, CellTracker Deep Red等）是一類經(jīng)典的熒光示蹤染料,。這些染料含有氯甲基集團(tuán),，體外實(shí)驗(yàn)顯示參與GST反應(yīng)，能與硫醇相互作用,，在大多數(shù)細(xì)胞中,，谷胱甘肽的表達(dá)水平都比較高，并且谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶也隨處可見,，因此這種染料添加到細(xì)胞培養(yǎng)物中,，經(jīng)過洗滌進(jìn)入細(xì)胞，能在細(xì)胞中存留多代,，并不會(huì)轉(zhuǎn)移到該群的其他細(xì)胞中去（僅有很小可能會(huì)通過縫隙連接轉(zhuǎn)移）,。這種探針在熒光染料的細(xì)胞存留能力上實(shí)現(xiàn)了一個(gè)突破，用于移植細(xì)胞和組織的長時(shí)間示蹤非常理想,。

2.細(xì)胞分化和增殖示蹤探針

CFDA, SE具有細(xì)胞膜滲透性,，本身不具有熒光發(fā)光性。當(dāng)通過被動(dòng)運(yùn)輸穿透細(xì)胞膜進(jìn)入活細(xì)胞后,，可被胞漿內(nèi)的酯酶催化生成羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE）,，后者可發(fā)強(qiáng)烈的綠色熒光，不能穿透細(xì)胞膜,，能完好的保留在胞內(nèi),。CFSE還可自發(fā)性并不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合從而偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上，同時(shí)過量且未被偶聯(lián)的CFDA, SE通過被動(dòng)擴(kuò)散回到細(xì)胞外培養(yǎng)基內(nèi),，被后續(xù)清洗步驟所清除,。經(jīng)CFDA, SE標(biāo)記的非分裂細(xì)胞的熒光非常穩(wěn)定，穩(wěn)定標(biāo)記的時(shí)間可達(dá)數(shù)月,，因此非常適用于細(xì)胞群落分析,。

CFDA, SE標(biāo)記細(xì)胞的熒光非常均一，優(yōu)于以前使用的其他細(xì)胞示蹤熒光探針如PKH26,，并且分裂后的子代細(xì)胞的熒光分配也更均一。在細(xì)胞分裂增殖過程中,，CFSE 標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中,，熒光強(qiáng)度變?yōu)橛H代細(xì)胞的一半，通過流式細(xì)胞儀（FL1通道）根據(jù)熒光強(qiáng)度的不同，可檢測出未分裂細(xì)胞,，分裂一次（1/2的熒光強(qiáng)度）,，二次（1/4的熒光強(qiáng)度），三次（1/8的熒光強(qiáng)度）,，以及更多分裂次數(shù)的細(xì)胞,。CFSA，SE可檢測分裂次數(shù)多達(dá)八次甚至更多,。經(jīng)CFDA, SE標(biāo)記的細(xì)胞可用于體外和體內(nèi)增殖研究,，且具有不會(huì)使鄰近細(xì)胞染色的功能。CFDA, SEzui常用于淋巴細(xì)胞的增殖檢測,，也可用于成纖維細(xì)胞,，自然殺傷細(xì)胞，造血祖細(xì)胞等其他細(xì)胞的增殖檢測,。

CFDA, SE標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光,，Ex=494nm，Em=521nm,，除了流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖外,，還可用熒光酶標(biāo)板定量活細(xì)胞數(shù)目，或者用熒光顯微鏡進(jìn)行均一染色的細(xì)胞示蹤觀察,。

另外,，還可提供CFDA，SE細(xì)胞增殖與示蹤檢測試劑盒,，試劑盒中包含配制CFDA,，SE儲(chǔ)存液所需的溶劑和細(xì)胞標(biāo)記用的染色緩沖液，簡化了實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備工作,。

七,、細(xì)胞骨架探針

1.微絲（F-actin）探針

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環(huán)狀七肽毒素,，選擇性結(jié)合于絲狀肌動(dòng)蛋白F-actin?？膳c多種熒光染料偶聯(lián),，如四甲基羅丹明 (TRITC) 、FITC ,、iFluor? 488,、iFluor? 647、iFluor? 555等,，通過標(biāo)記組織切片,，細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞體系中的絲狀肌動(dòng)蛋白,，從而對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析。

該系列產(chǎn)品具有以下特點(diǎn)：

親和力高：Kd= 20 nM,；

特異性強(qiáng)：選擇性結(jié)合于絲狀肌動(dòng)蛋白F-actin,，而不會(huì)與單體肌動(dòng)蛋白G-actin結(jié)合；

優(yōu)于抗體染色：不同于Actin抗體,，鬼筆環(huán)肽無物種限制性,，適用范圍廣；且?guī)缀醪淮嬖诜翘禺愋詤^(qū)域,，染色區(qū)和非染色區(qū)域?qū)Ρ刃詷O其明顯,；

靈敏度高：納摩爾濃度（nM）染色即可滿足實(shí)驗(yàn)要求；

兼容性好,，肌動(dòng)蛋白活力不受影響：鬼筆環(huán)肽衍生物很小,，直徑約12-15?，分子量＜2000 Da,，標(biāo)記后的肌動(dòng)蛋白許多生理特性都得以維持,；

適用范圍廣：無物種差異性；同樣適用于甲醛固定和打孔處理后的組織樣本,。

2.G-actin探針

Alexa Fluor? 488標(biāo)記Deoxyribonuclease I選擇性結(jié)合G-actin（球狀）,，發(fā)明亮的綠色熒光，并可以檢測固定細(xì)胞中未聚合的肌動(dòng)蛋白（actin）,。

3.微管 (microtubulin - polymerized tubulin)探針

Tubulin Tracker Green 是不帶電的無熒光化合物,，易于穿過活細(xì)胞的質(zhì)膜。 一旦進(jìn)入細(xì)胞,，親脂性封閉基團(tuán)被非特異性的脂酶切割,，得到綠色熒光的帶電形式。主要用于對(duì)活細(xì)胞中多聚化的微管蛋白染色,。

八、細(xì)胞核染色

1.常用的細(xì)胞核熒光探針

碘化丙啶（PI）是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑,，是一種溴化乙啶的類似物,，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。不可透過完整細(xì)胞膜,，但卻能穿過破損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色,。紅色熒光（Ex=540nm，Em=608nm）,。

DAPI,，也稱DAPI dihydrochloride，與雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光,。和EB(ethidium bromide)相比,，對(duì)雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍,。因?yàn)?/span>DAPI是含有特定AT序列DNA的一種嵌入劑，它能像Hoechst染料一樣粘附在DNA雙螺旋的小溝區(qū),。DAPI可以透過完整細(xì)胞膜對(duì)DNA染色。藍(lán)色熒光（Ex=364nm,，Em=454nm）。

7-氨基放線菌素（7-AAD）是一種細(xì)胞核熒光染料,，嵌入雙鏈DNA，不可透過完整細(xì)胞膜,，隨著細(xì)胞凋亡,、細(xì)胞死亡過程,，質(zhì)膜對(duì)7-AAD的通透性逐漸增加。廣泛用于FACS,，熒光強(qiáng)度雖低于PI,，但是適合于FITC，PE同時(shí)檢測,。紅色熒光（Ex=488nm，Em=650nm）,。

Hoechst 33258是一種藍(lán)色細(xì)胞核熒光染料,，嵌入雙鏈DNA小溝，可以透過完整細(xì)胞膜,。嵌入雙鏈DNA后釋放強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光,，對(duì)細(xì)胞的毒性較低。常用于細(xì)胞凋亡檢測,，根據(jù)正常和凋亡時(shí)期染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的差異,。普通細(xì)胞核染色。藍(lán)色熒光（Ex=352nm,，Em=461nm）。

Hoechst 33342 是一種藍(lán)色細(xì)胞核熒光染料,，嵌入雙鏈DNA小溝,，可以透過完整細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞毒性較低,。常用于細(xì)胞凋亡檢測,，及普通細(xì)胞核染色,。藍(lán)色熒光（Ex=350nm，Em=461nm）,。

2.細(xì)胞核定位載體

細(xì)胞核定位載體用于研究重組蛋白在細(xì)胞核（Endoplasmic reticulum）的定位及功能的便利的工具,。研究人員可以根據(jù)自己的研究目的選擇相應(yīng)的定位表達(dá)載體，再將感興趣的ORF片段構(gòu)建到表達(dá)載體中進(jìn)行研究,。 

陽性對(duì)照可以表達(dá)GFP,，且同樣定位在細(xì)胞核上。