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Alkaline Phosphatase Activity Detection Kit
堿性磷酸酶活性檢測試劑盒
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 儲存 | 價格（元） |
Alkaline Phosphatase Activity Detection Kit 堿性磷酸酶活性檢測試劑盒 | 20801ES60 | 100T | -20℃ | 319.00 |
產(chǎn)品描述
堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,，簡寫為ALP或AKP），又稱堿性磷酸酯酶,，是一組同工酶,，目前已發(fā)現(xiàn)六種ALP1-ALP6。廣泛分布于人體肝臟,、骨骼,、腸、腎和胎盤等組織,，是經(jīng)肝臟向膽外排出的一種酶,。堿性條件下可催化磷酸酯鍵的水解，從而將底物分子上的磷酸基團去除,，轉(zhuǎn)化為羥基,。此類底物包括核酸（DNA、RNA）,、蛋白,、生物堿等。常見的有腸道堿性磷酸酶,、非組織特異性堿性磷酸酶,、胎盤堿性磷酸酶等,；生物學(xué)中堿性磷酸酶（ALP）水平的變化及其活性的高低常被作為一種檢測組織行為的指標，如：1）作為iPS成功誘導(dǎo)的標志,；ALP在大多數(shù)細胞類型中均有表達,，但是在iPS細胞內(nèi)的表達水平明顯升高；2）結(jié)腸癌細胞分化程度定性和定量的指標,；3）血清中堿性磷酸酯酶的升高可導(dǎo)致高堿性磷酸酶血癥,，常被認為和惡性膽管阻塞，原發(fā)性硬化膽管炎,，肝癌,，肝硬化等肝膽疾病密切相關(guān)；4）血清中堿性磷酸酶活性升高還和骨骼損傷導(dǎo)致的骨生成,，以及骨骼疾病如纖維骨炎,、佝僂病、成骨不全等密切相關(guān),；5）堿性磷酸酶水平也會出現(xiàn)一些病理性降低的情況,，多見于重癥慢性腎炎、兒童甲狀腺機能不全,、貧血等,。對于正常成人來說，血清內(nèi)ALP的范圍為40-150U/L,。
對硝基苯磷酸（p-nitrophenyl phosphate, pNPP）是一種常用的磷酸酶顯色底物,，堿性條件下，可在ALP作用下生成對硝基苯酚（p-nitrophenol, pNP）,，后者在堿性環(huán)境下呈黃色產(chǎn)物,，并在405nm處可檢測到zui大吸收峰。產(chǎn)物黃色越深,，說明ALP活性越高,，反之則活性越低。因此,，通過檢測OD405吸光值即可計算ALP活性水平,。
本品為堿性磷酸酶活性檢測試劑盒，可快速,、便捷地檢測細胞或組織裂解液/勻漿液,、血清、血漿,、尿液,、純化酶等樣品中的ALP活性。該試劑盒包括標準品和空白對照,，可進行達100個樣品的檢測,。
產(chǎn)品組分
組分編號 | 組分名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格（10T） | 儲存方法 |
20801-A | ALP反應(yīng)緩沖液 ALP Assay Buffer | 15ml | -20℃ |
20801-B | 顯色底物 pNPP Substrate | 2管 | -20℃避光 |
20801-C | pNP標準品溶液p-nitrophenol Standard | 100ul (10mM) | -20℃避光 |
20801-D | 反應(yīng)終止液 Stop Solution | 12ml | -20℃ |
保存條件
冰袋運輸,。-20℃保存，一年有效,。其中顯色底物,、pNP標準溶液需要避光保存。
注意事項
- 如果進行酶活力的定量,，進行酶反應(yīng)時必須注意計時,。此時推薦孵育30min等較長時間，以減小操作過程中的時間誤差,。如果樣品中酶活性較高,，則可以預(yù)先適當稀釋樣品。
2）樣品溶液中須避免出現(xiàn)EDTA,、氟離子,、檸檬酸鹽等堿性磷酸酶抑制劑。
3）ALP反應(yīng)緩沖液和p-nitrophenol標準品溶液對人體有害,，請注意適當防護,。反應(yīng)終止液有腐蝕性，請小心操作,。
4）為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明
- 試劑準備
將所有試劑取出,，恢復(fù)至室溫使用。
- 顯色底物溶液：取一管顯色底物,，溶解于2.5ml的ALP反應(yīng)緩沖液中,，充分溶解和混勻，冰上放置,。注意：新鮮配制的顯色底物溶液需在數(shù)小時（≤ 6h）內(nèi)使用,。
- 標準品工作液：取10μl p-nitrophenol標準品溶液(10mM)，用ALP反應(yīng)緩沖液稀釋至0.2ml,，使得終濃度為0.5mM,。
2．樣品準備
- 細胞或組織裂解液的準備：采用適當細胞或組織裂解液裂解細胞和組織，如果有必要需進行適當勻漿,，隨后離心取上清,，用于ALP活性的檢測。注意：裂解液中不能含有磷酸酶抑制劑,。樣品可以-80℃凍存,，避免反復(fù)凍融。
- 血漿,、血清和尿液的準備：血漿和血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于本試劑盒的測定,，但為了消除樣品本身顏色的干擾,，需設(shè)置加了血漿或血清但不加底物的對照。注意：血漿制備不能用含EDTA和檸檬酸鹽的抗凝管,。尿液通常也可以直接用于測定,。上述樣品可以-80℃凍存，避免反復(fù)凍融,。
- 樣品的稀釋：若樣品中含有較高活性的ALP,，可以使用原有的裂解液或PBS等進行稀釋，也可以采用試劑盒中的ALP反應(yīng)緩沖液進行稀釋,。若使用上述反應(yīng)緩沖液進行稀釋,，需保留足夠的緩沖液用于試劑盒的檢測過程。
3．加樣
參考下表使用96孔板設(shè)置空白對照孔,、標準品孔和樣品孔,。標準品的用量分別為4、8,、16,、24、32和 40μl,，樣品通?？梢灾苯蛹?/span>50μl。如果樣品中的堿性磷酸酶活性過高,，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定,。
表1 各組分加樣數(shù)據(jù)表
| 空白對照（Blank） | 標準品（Standard） | 樣品（Sample） |
ALP反應(yīng)緩沖液 | 50μl | (100-x)μl | (50-y) μl |
顯色底物 | 50μl | － | 50μl |
樣品 | － | － | yμl |
標準品工作液 | － | xμl | － |
4. 混勻：用槍頭輕輕吹打混勻，也可借助搖床進行混勻,。
5. 孵育：37℃孵育5-10min,。（待測樣品中ALP活性較低時，可適當延長孵育時間至30min）
6. 終止：每孔加入100μl反應(yīng)終止液終止反應(yīng),。此時,，標準品或有ALP活性的孔會呈現(xiàn)不同深淺的黃色。
7. 檢測：405nm測定吸光度,。如果不能測定405nm,，也可以在400-415nm范圍內(nèi)檢測吸光度。如果不能立即測定,，可以在數(shù)小時內(nèi)完成測定,，所顯現(xiàn)的黃色在數(shù)小時（≤ 6h）內(nèi)穩(wěn)定。
8. 結(jié)果分析
堿性磷酸酶活性單位的定義：在pH9.8的二乙醇胺（diethanolamine, DEA）緩沖液中,，37℃條件下,，每分鐘水解pNPP顯色底物產(chǎn)生1μM p-nitrophenol所需的ALP量定義為一個酶活力單位，也被稱作一個DEA酶活力單位。在pH9.6的甘氨酸緩沖液中,，25℃條件下,，每分鐘水解pNPP顯色底物產(chǎn)生1μM p-nitrophenol所需的ALP量定義為一個酶活力單位，也被稱作一個甘氨酸酶活力單位,。一個甘氨酸酶活力單位約相當于3個DEA酶活力單位,。本試劑盒測定的是DEA酶活力單位。
zui后,，根據(jù)酶活性單位的定義,，計算出樣品中的堿性磷酸酶活性。
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