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Hieff CloneTM Multi One Step Cloning Kit
多片段一步法快速克隆試劑盒
產品信息
產品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 儲存 | 價格（元） | *（元） |
Hieff CloneTM Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆試劑盒 | 10906ES10 | 10T | -20℃ | 449.00 | 380.00 |
10906ES50 | 5×10T | -20℃ | 1939.00 | 1710.00 |
產品描述
Hieff CloneTM Multi One Step Cloning Kit是一款簡單、快速,、的多片段DNA定向克隆產品,，該試劑盒可以將PCR產物定向克隆至任意載體的任意位點。將載體在克隆位點進行線性化，并在插入片段PCR引物5’端引入線性化克隆載體末端序列，使得插入片段PCR產物5’和3’zui末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應的*一致的序列 (15 bp～20 bp)。將這種兩端帶有載體末端序列的PCR產物和線性化克隆載體按一定比例混合,，在重組酶Exnase的催化下，僅需反應30 min即可進行轉化,，完成定向克隆,?？寺￡栃月士蛇_95%以上,。克隆載體酶切產物或PCR產物和插入片段PCR產物可以不進行DNA純化直接用于重組克隆,，極大的簡化了實驗步驟,。
試劑盒中包含有針對多片段重組反應而優(yōu)化的反應緩沖液和重組酶Exnase MultiS。使用該試劑盒,，可以一次實現多至5個片段的順序拼接克隆,。Exnase MultiS還兼容常規(guī)酶切、PCR反應體系,。
該試劑盒可用于多片段拼接克隆,、全基因合成和DNA定點突變。
產品組分
產品編號 | 組分名稱 | 產品編號/規(guī)格 | |
10906ES10 (10T) | 10906ES50 (5×10T) | ||
10906-A | 5×CE MultiS Buffer | 40 μl | 40 μl×5 |
10906-B | Exnase MultiS | 20μl | 20μl×5 |
10906-C | pUC 19 control vector, linearized (50 ng/μl) | 5μl | 5μl×5 |
10906-D | Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl) | 5μl | 5μl×5 |
運輸與保存方法
冰袋（wet ice）運輸,。產品-20 oC保存,。
實驗流程
實驗流程概覽
1) 線性化克隆載體制備；
2) 插入片段擴增引物設計,；
3) 插入片段PCR擴增,；
4) 進行重組反應；
5) 反應產物轉化,、涂板,；
- 克隆鑒定。
|
圖一 實驗流程概覽
- 制備線性化克隆載體
選擇合適的克隆位點，并對克隆載體進行線性化,。推薦您盡量選擇無重復序列且GC含量均勻的區(qū)域進行克隆,。當載體克隆位點上下游20 bp區(qū)域內GC含量均在40%～60%范圍之內時,，重組效率將達到zui大。
線性化載體可通過限制性內切酶酶切（單酶切或雙酶切）或反向PCR擴增獲得,。
A．酶切制備線性化克隆載體
雙酶切線性化：線性化*,，轉化背景 (假陽性克隆) 低。推薦使用,。
單酶切線性化：線性化程度較差,。可適當延長酶切時間以降低轉化背景,。
注：1）Hieff CloneTM MultiS重組反應體系內無DNA連接酶,，不會發(fā)生載體自連反應。因此,，即使是以單酶切方式制備的線性化載體也無需進行末端脫磷酸處理,。重組產物轉化后出現的假陽性克隆 (無插入片段) 是由未線性化環(huán)狀載體轉化而形成的。如這種假陽性克隆比例較高,，應重新制備線性化克隆載體,。
2） Hieff CloneTM MultiS重組反應體系兼容幾乎所有的酶切反應體系?？寺≥d體酶切產物加熱失活內切酶(參見內切酶使用說明書,，例如Hind III，65℃孵育20 min*失活)后可直接用于重組反應,。
B．反向PCR擴增制備線性化克隆載體
推薦您使用高保真聚合酶進行載體擴增 (HieffTM Pfu DNA Polymerase,， Cat No. 10113ES60) 以減少擴增突變的引入。PCR擴增模板應盡量使用預線性化質粒,，以防止殘留環(huán)狀質粒模板對克隆陽性率的影響,。
Hieff CloneTM MultiS重組反應體系兼容常規(guī)PCR反應體系。因此,，如擴增模板為預線性化質粒且PCR產物電泳條帶單一,，擴增產物可以無需純化直接用于重組反應。
克隆載體酶切產物或PCR 擴增產物DNA 純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質粒,，直接使用進行重組反應時,，重組效率、克隆陽性率都會有所降低,。因此,，在進行較大片段(>5kb) 克隆時，我們推薦您使用高質量的試劑盒對線性化克隆載體進行膠回收純化,，以提高DNA 純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體 (其電泳位置不同于線性化克隆載體),。不同方式制備的線性化克隆載體的使用方式可查閱表一。
表一：線性化克隆載體的使用方式
線性化載體制備方式 | 模板類型 | 快速實驗方案 | *實驗方案 | |
酶切消化制備 | 環(huán)狀質粒 | 加入失活內切酶后直接使用 | 膠回收 | |
PCR制備 | 擴增特異 | 環(huán)狀質粒 | DpnI消化后直接使用（降解擴增模板） | 膠回收或DpnI消化后膠回收 |
預線性化質粒,、基因組,、cDNA | 直接使用 | 膠回收 | ||
有明顯非特異性擴增 | 膠回收 | |||
注：直接使用酶切產物或擴增產物進行重組反應時,，使用體積不應超過4μl（重組反應總體積的1/5）
- 制備PCR產物
2.1設計擴增引物
Hieff CloneTM MultiS引物設計總的原則是：通過在引物5’端引入線性化克隆載體末端同源序列，使得插入片段擴增產物5’和3’zui末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應的*一致的序列 (15 bp～20 bp),。
首先設計*片段的正向擴增引物和第三片段的反向擴增引物(與載體相鄰的兩個插入片段),。
*片段正向擴增引物設計方式：
5’——上游載體末端同源序列+*片段基因特異性正向擴增序列——3’
第三片段反向擴增引物設計方式：
3’——第三片段基因特異性反向擴增序列+下游載體末端同源序列——5’
基因特異性正/反向擴增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴增引物序列；
上游/下游載體末端同源序列為線性化克隆載體zui末端序列（用于同源重組）,。
以pUC18作為克隆載體,、進行三插入片段順序拼接克隆（5’至3’按克隆順序依次為：*片段,、第二片段,、第三片段）為例，引物設計方案如圖二所示,。
![C:\Documents and Settings\Administrator\Application Data\Tencent\Users\2499904861\\WinTemp\RichOle\36@_SW[D_9O)RE}D][KJA)O.jpg](file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtml1/01/clip_image004.jpg)
圖二：重組引物設計方案
注：如zui終引物長度超過40bp,，我們推薦您在引物合成時選用PAGE純化，可提高克隆成功率,。計算擴增引物退火溫度時,，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值,，載體末端同源序列不應參與計算,。
其次設計*片段的反向擴增引物和第二片段的正向擴增引物。用于片段之間進行重組的同源序列可以添加至前方片段的反向擴增引物中,，也可以添加至后方片段的正向擴增引物中,，還可以兩片段各添加一部分。以將同源序列添加至前方片段 (*片段)的反向擴增引物中為例,，引物具體設計方案如圖三所示：
*片段正向擴增引物設計方式：
3’——*片段基因特異性反向擴增序列+第二片段5’端同源序列——5’
第二片段正向擴增引物設計方式：
5’——第二片段基因特異性正向擴增序列——3’
基因特異性正/反向擴增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴增引物序列,；第二片段5’端同源序列即用于*片段與第二片段進行重組的添加序列。zui后設計第二片段的反向擴增引物和第三片段的正反向擴增引物,。設計方式與*片段的反向擴增引物和第二片段的正向擴增引物設計方式一致,。具體方案參見圖三。
圖三：*片段的反向擴增引物和第二片段的正向擴增引物設計示意圖
注：如zui終引物長度超過40bp,，我們推薦您在引物合成時選用PAGE純化,，可提高克隆成功率。計算擴增引物退火溫度時,，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值,，載體末端同源序列不應參與計算。
2.2 插入片段PCR擴增
插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 擴增,，無需考慮產物末端有無A加尾 (重組過程中將被去除,，在zui終載體中不會出現)。我們推薦您使用高保真聚合酶進行擴增(HieffTM Pfu DNA Polymerase,， Cat No. 10113ES60),，以減少擴增突變的引入,。
PCR結束后，取少量產物進行瓊脂糖電泳以檢驗擴增產量和特異性,。Hieff CloneTM MultiS重組反應體系兼容常規(guī)PCR反應體系,。因此，如擴增模板不是與克隆載體抗性相同的環(huán)狀質粒,，且PCR產物電泳條帶單一,，擴增產物可以無需純化直接用于重組反應。
PCR擴增產物DNA純度較低,，直接使用進行重組反應時,，重組效率、克隆陽性率都會有所降低,。因此,，在進行較大片段 (>5 kb) 克隆實驗時，我們推薦您使用高質量的試劑盒對擴增產物進行膠回收純化以提高DNA純度,。插入片段擴增產物的使用方式可查閱表二,。
表二：擴增產物推薦使用方式
PCR擴增情況 | PCR模板類型 | 快速實驗方案 | *實驗方案 |
擴增特異 | 與克隆載體抗性相同的環(huán)狀質粒 | DpnI消化后直接使用* | 膠回收或DpnI消化后膠回收 |
預線性化質粒、基因組,、cDNA | 直接使用 | 膠回收 | |
有明顯非特異性擴增 | 膠回收 | ||
注：直接使用擴增產物進行重組反應時,，使用體積不應超過4μl（重組反應總體積的1/5）
*當線性化克隆載體為酶切制備時，插入片段擴增產物經DpnI消化結束后應置于85℃加熱20 min將DpnI 失活,，以避免重組反應時殘留DpnI 對克隆載體的降解,。
- 重組反應
3.1 配制反應體系
于冰水浴中配制如下反應體系。如果不慎將液體粘在管壁,，可通過短暫離心使其沉入管底,。
ddH2O | Up to 20 μl |
5×CE MultiS Buffer | 4 μl |
線性化克隆載體 | X ng |
插入片度擴增產物 | X ng |
Exnase MultiS | 2 μl |
Hieff CloneTM MultiS重組反應體系zui適DNA使用量為每片段（包括線性化克隆載體）0.03 pmol。該摩爾數對應的DNA質量可由以下公式粗略計算獲得：
每片段zui適使用量 = [0.02×克隆載體堿基對數]ng (0.03 pmol)
例如,，將長度為0.5kb,、1kb、2 kb三插入片段克隆至長度為5 kb的克隆載體時,，各片段zui適使用量應為：
線性化克隆載體zui適使用量：0.02 × 5000 = 100 ng
0.5 kb插入片段zui適使用量應為：0.02 × 500 = 10 ng
1 kb插入片段zui適使用量應為：0.02 × 1000 = 20 ng
2 kb插入片段zui適使用量應為：0.02 × 2000 = 40 ng
注：1）線性化克隆載體的使用量應在50～200 ng之間,。當使用上述公式計算DNAzui適使用量超出這個范圍時，直接選擇zui低/zui高使用量即可,。
2）插入片段DNA使用量應大于10 ng,。當使用上述公式計算DNAzui適使用量低于這個值時，直接使用10 ng即可,。
3）線性化克隆載體和插入片段擴增產物不進行DNA純化直接使用時,，加入總體積應不超過反應體系體積的1/5，即4 μl。
4）試劑盒中提供pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl)和Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl)各5 μl,，需要時可進行陽性對照反應,，每次反應各加1 μl。
3.2 重組反應
1） 體系配制完成后,，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分,，避免產生氣泡 (請勿劇烈震蕩或者渦旋混勻) 。
2） 置于37℃反應30 min,。
3） 待反應完成后,，立即將反應管置于冰水浴中冷卻5 min。
4） 反應產物可直接進行轉化,；也可儲存于-20℃,，待需要時解凍轉化。
注：我們推薦您在PCR儀或者水浴鍋等溫控比較的儀器上進行反應,。重組效率在反應30 min左右達到zui高,，反應時間不足或者太長都將會降低克隆效率。
4. 重組產物轉化,、涂板
1） 取20 μl冷卻反應液,，加入到200 μl感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數下混勻,，在冰上放置30 min,。
2） 42℃熱激45～90秒，冰水浴孵育2 min,。
3） 加入900 μl SOC或LB培養(yǎng)基,，37℃孵育10 min充分復蘇。37℃搖菌45 min,。
4） 取100 μl菌液均勻涂布在含有適當抗生素的平板上。將平板倒置,，于37℃24H培養(yǎng),。
注：我們推薦您用轉化效率>108 cfu/μg的感受態(tài)細胞。如果感受態(tài)轉化效率<108 cfu/μg(例如用CaCl2法新鮮制備的感受態(tài)轉化效率通常在106-107 cfu/μg之間) ,，請將培養(yǎng)菌液在5000 rpm離心3 min收集菌體,，用100 μl LB培養(yǎng)基重懸后全部涂板。
5. 克隆鑒定
zui方便快捷的方法是菌落PCR,。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至20～50 μl LB 培養(yǎng)基中混勻,，直接取1 μl作為PCR模板。
我們推薦您至少用一條通用測序引物進行菌落PCR,，這樣可以避免PCR假陽性的產生,。
將PCR陽性菌落的剩余菌液接種至含有適當抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24H，提取質粒做后續(xù)的鑒定。
注意事項
為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。
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