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內(nèi)毒素的概念
已知,，凡是能造成生物機體體溫上升的物質(zhì)均可稱為熱原（Pyrogen）,，其來源可能多樣化。而細菌內(nèi)毒素（Endotoxin）是熱原的一種,，它是細菌性感染的一個重要致病因素,。
內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌菌體中存在的毒性物質(zhì)總稱，為多種革蘭氏陰性菌細胞壁上的teyou結(jié)構(gòu),。細菌內(nèi)毒素主要由磷脂,、脂蛋白和脂多糖（LPS）組成，其中脂多糖（LPS）是天然或?qū)嶒炇抑苽涞膬?nèi)毒素復(fù)合物的生物活性部分,，發(fā)揮毒性作用的是類脂質(zhì)A（Lipid A）,。不同革蘭氏陰性菌的脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)基本相似，所以由此類細菌引起的感染導(dǎo)致的毒性效應(yīng)大致相同,，主要表現(xiàn)為發(fā)熱,、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等,。細菌在存活狀態(tài)時不會釋放內(nèi)毒素,，但當細菌死亡裂解或者自溶后，內(nèi)毒素會被大量釋放出來,。
圖1.革蘭氏陰性菌結(jié)構(gòu)圖
細菌內(nèi)毒素耐熱性和化學(xué)穩(wěn)定性很強,，一般的方法很難將其去除或滅活，如：常規(guī)高壓滅菌法也不能將內(nèi)毒素chedi清除,，一般的化學(xué)藥品也不會影響細菌內(nèi)毒素的活性,，只有強酸、強堿或強氧化劑可以破壞其結(jié)構(gòu),。但內(nèi)毒素具有水溶性,，生產(chǎn)中可用無熱原水沖洗以除去熱原；其還具有被吸附性,，可用活性碳將其吸附,。
細菌內(nèi)毒素是目前最危險和最常見的致熱污染物之一,，主要原因為：它在自然界中無處不在（革蘭氏陰性菌即使在干凈的水中也能繁殖）、毒性強,、在jiduan條件下也很穩(wěn)定,、生產(chǎn)過程中很容易引入。對于日常的生命科學(xué)實驗,，使用細菌制備的質(zhì)粒DNA和重組蛋白中都會有內(nèi)毒素的殘留,，而且很難去除干凈，進而對后續(xù)實驗帶來潛在毒性影響,。內(nèi)毒素的主要成分脂多糖有強烈的免疫活性和細胞毒性并產(chǎn)生復(fù)雜的細胞生物學(xué)效應(yīng),，因此大多數(shù)情況下會明顯干擾并產(chǎn)生不可預(yù)測的實驗結(jié)果。對生物系統(tǒng),，當人（或動物）體血液系統(tǒng)的輸入液中混入微量的細菌內(nèi)毒素時,，可激活組織內(nèi)的炎性細胞和炎癥因子，導(dǎo)致機體發(fā)熱并產(chǎn)生全身性炎癥反應(yīng),，在很短時間內(nèi)將會使人產(chǎn)生昏迷和高燒,，若不及時搶救，很可能危及生命,。
因此,，無論是用于生命科學(xué)研究的可能含有內(nèi)毒素的相關(guān)試劑，還是用于人和動物預(yù)防或治療的化學(xué)藥品,、抗生素,、生物制品等的原輔料、中間品和放行產(chǎn)品均需要進行內(nèi)毒素檢測,，以確保有效性和安全性,。
內(nèi)毒素檢測及法規(guī)監(jiān)管要求
從20世紀開始，內(nèi)毒素檢測方法相繼出現(xiàn),。
1942年,，美國藥典首先收載家兔法檢測熱原（RPT法）。該方法可以檢測所有類型的熱原物質(zhì),；但有其缺點,，即動物個體差異大導(dǎo)致檢測靈敏度低，對于毒性大的藥物如放射性藥物或腫瘤抑制劑等無法進行檢測,，是定性而非定量方法,，不能用于藥品生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。
1980年,，F(xiàn)DA發(fā)布用鱟試劑來檢測人用和獸用注射藥成品的內(nèi)毒素,；同年，《美國藥典》收載細菌內(nèi)毒素檢測法,，但在藥典各品種正文中未涉及,。
1995年,，美國藥典23版1至7增補本除了經(jīng)典的凝膠法(LAL)外，還收載了動態(tài)濁度法,、動態(tài)顯色法,、終點顯色法。
2005年版《中國藥典》也有規(guī)定熱原檢查采用家兔法,，細菌內(nèi)毒素檢查采用鱟試劑法,。鱟試劑法具有易操作、靈敏度高,、可用于內(nèi)毒素定量檢測等優(yōu)點，但也有其不便之處,，如：鱟血批次間有差異,，對革蘭氏陰性菌以外的內(nèi)毒素不靈敏，易受β-葡聚糖(β-Glucans)影響而產(chǎn)生假陽性,，鱟受到動物保護,，無法大批量供應(yīng)。
鑒于上述情況,，國內(nèi)外藥典法規(guī)也提出了一些新的內(nèi)毒素檢測方法,。如：2020版《中國藥典》（四部）9251章節(jié)中提到可以采用重組C因子法檢測細菌內(nèi)毒素（C因子是鱟試劑中對細菌內(nèi)毒素敏感的蛋白，能夠選擇性識別內(nèi)毒素）,。美國藥典(USP)專家委員會也已于2024年7月26日批準將USP<86>Bacterial Endotoxins Test Using Recombinant Reagents納入《美國藥典-國家處方集》,，USP<86>章節(jié)于2024年11月發(fā)布，并于2025年5月正式生效,。重組C因子法(rFc)通過重組方法產(chǎn)生C因子,，具有：C因子來源穩(wěn)定，受批次影響??；操作簡單快速；更強的抗干擾能力（不受β-glucans影響）,；專屬性好等優(yōu)點,。該方法也有其缺點，主要為來源于不同品質(zhì)鱟血蛋白序列的重組蛋白對內(nèi)毒素的反應(yīng)性可能不同,。
圖2.中外法規(guī)里列舉的內(nèi)毒素檢測方法
重組C因子內(nèi)毒素檢測方法
2020版《中國藥典》（三部）針對細菌內(nèi)毒素檢測,，收錄了包括凝膠法和光度法在內(nèi)的共6種細菌內(nèi)毒素檢查方法。
凝膠法和光度法等都需要從海洋節(jié)肢動物鱟中取鱟血作為原料,，而鱟目前已呈瀕?，F(xiàn)狀，亟需尋求替代方法,。2020版《中國藥典》（四部）9251章節(jié)中提到可以采用重組C因子法檢測細菌內(nèi)毒素,。此外,，美國、歐洲和日本藥典也都提到可以采用重組C因子法檢測細菌內(nèi)毒素,。
表1.各種內(nèi)毒素檢測方法介紹
目前,，行業(yè)內(nèi)對于內(nèi)毒素的檢測，雖然仍以鱟試劑方法為主,，但也逐漸接受重組C因子的檢測方法,。為此，翌圣生物自主研發(fā)了重組C因子內(nèi)毒素檢測試劑盒,。
本試劑盒通過基因重組的方式表達C因子,，然后重組C因子被待測樣本中的細菌內(nèi)毒素激活，進而酶切水解熒光底物,，產(chǎn)生與內(nèi)毒素濃度成比例的熒光信號,，根據(jù)熒光信號值檢測內(nèi)毒素含量。本試劑盒可以用于人類疾病治療的注射藥物（如化學(xué)藥品,、抗生素,、生物制品等）和醫(yī)療器械（包括透析液、植入式器械等）的原輔料,、研發(fā)和生產(chǎn)工藝過程以及商業(yè)化進程中的內(nèi)毒素檢測,。
產(chǎn)品特點
安全穩(wěn)定：合成試劑，不依賴動物源性成分,，具有更高的批間一致性,、安全性及可持續(xù)性；
強特異性：重組技術(shù)消除了鱟試劑中β-1,3-葡聚糖對檢測結(jié)果的干擾,，提高特異性和準確性,；
高靈敏度：檢測范圍0.005-5EU/mL，定量下限(LLOQ)低至0.005EU/mL,；
高精密度：批內(nèi)重復(fù)性高CV＜10%,，批間差異小即中間精密度CV＜15%；
快速便捷：僅需1h即可完成檢測,；
驗證完善：參考ICH Q2（R2）分析方法驗證指導(dǎo)原則,，可提供完善的驗證報告。
實驗數(shù)據(jù)
試劑盒檢測范圍為0.005~5EU/mL,，R2=0.9968,，各濃度檢測值CV≤10%。
圖3.重組C因子內(nèi)毒素檢測試劑盒標準曲線
該重組C因子內(nèi)毒素檢測試劑盒不受鱟試劑中β葡聚糖的干擾,，避免了因β-葡聚糖引起的假陽性/結(jié)果不準確情況,。
表2.不同內(nèi)毒素檢測方法數(shù)據(jù)對比
產(chǎn)品信息
類別 | 產(chǎn)品 | 貨號 | 品名 | 規(guī)格 |
重組C因子法 內(nèi)毒素檢測 | 重組C因子試劑盒 | 36723ES | Recombinant Factor C Endotoxin Detection Kit 重組C因子內(nèi)毒素檢測試劑盒 | 48 T/96 T |
動態(tài)濁度法 內(nèi)毒素檢測 | 動態(tài)濁度法 內(nèi)毒素試劑 | 60401ES | Kinetic Turbidimetric LAL Assays 動態(tài)濁度法內(nèi)毒素檢測鱟試劑 | 17 T |
內(nèi)毒素去除 | 內(nèi)毒素去除試劑盒 | 60404ES | Endotoxin Removal Kit 內(nèi)毒素去除試劑盒 | 1 Kit |
