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抗體藥物是以細(xì)胞工程技術(shù)和基因工程技術(shù)為主體的抗體工程技術(shù)制備的藥物，具有特異性高,、性質(zhì)均一,、可針對特定靶點定向制備等優(yōu)點，目前被廣泛用在抗腫瘤領(lǐng)域和自身免疫類領(lǐng)域的疾病治療中,?；诳贵w的生物療法是制藥市場增長最快的細(xì)分市場之一，因其具有高選擇性和理想的藥理學(xué)特性,，且同小分子藥相比,，研發(fā)周期短、開發(fā)成功率高,。根據(jù)Frost & Sullivan的統(tǒng)計預(yù)測,，到2030年全球抗體藥物市場規(guī)模預(yù)計增至4,431億美元，中國的抗體藥物市場規(guī)模預(yù)計達(dá)5108億,，CAGR近20%,。

抗體類藥物可以分為：單克隆抗體、雙特異性抗體,、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）,、Fc融合蛋白、抗體片段和多克隆抗體等,。目前全球及中國抗體藥物市場均以單克隆抗體為主,，未來將向多特異性抗體發(fā)展，ADC藥物的市場規(guī)模國內(nèi)外也都在迅速增長,。

抗體藥物從早期研發(fā),、到成功上市需要經(jīng)歷多個階段，每個階段都存在極其復(fù)雜的不確定性,，需要對其中多個關(guān)鍵點進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制,，從而確保最終產(chǎn)品的安全性和有效性。

圖1.抗體藥研發(fā)及生產(chǎn)流程中翌圣質(zhì)控產(chǎn)品推薦

相較于傳統(tǒng)化學(xué)藥物,，以基因治療,、細(xì)胞治療或組織工程為基礎(chǔ)的新型生物治療業(yè)已成為前沿性治療藥物,。這些藥物大多以細(xì)胞為載體制備或構(gòu)建，因此,，在此過程中,，對于細(xì)胞種子庫、病毒培養(yǎng)和收獲,、臨床治療用途的細(xì)胞等生物制品中生產(chǎn)制備過程易受到支原體污染,。

支原體是一種比較常見但通常難以去除的污染類型，對于涉及細(xì)胞培養(yǎng)的生物制品工藝過程,，法規(guī)要求“必須確保無支原體污染",。目前國內(nèi)外藥典推薦的支原體檢測方法主要是基于培養(yǎng)法、NAT(核酸擴(kuò)增法)法,、細(xì)胞培養(yǎng)指示法,。

翌圣生物MycAway®支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）(2G)是基于NAT法的一種快速定性檢測生產(chǎn)原料、細(xì)胞庫,、病毒種子,、病毒或細(xì)胞收獲液、治療用細(xì)胞中潛在支原體污染的產(chǎn)品,。該試劑盒基于定量PCR技術(shù),，使用Taqman熒光探針定性檢測待測樣本中支原體DNA，可覆蓋183種支原體DNA序列,；并且嚴(yán)格按照EP 2.6.7和JP G3支原體檢測相關(guān)指南和要求進(jìn)行驗證,，具備靈敏度高、特異性好,、安全性好等特點,。該試劑盒還能夠與MolPure®磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒搭配使用，通過手動提取或者使用自動化核酸提取儀自動提取樣本核酸,，再由qPCR收集探針的熒光信號,，從而對檢測結(jié)果進(jìn)行判定,。

圖2.翌圣生物NAT法支原體qPCR檢測實驗流程

去除宿主細(xì)胞雜質(zhì)是抗體藥物在內(nèi)的生物制藥產(chǎn)品生產(chǎn)中的關(guān)鍵步驟,，其中宿主細(xì)胞殘留DNA由于可能存在的免疫原性、感染性以及致瘤性等安全問題成為關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo),。在此情況下,，建立合適的檢測方法監(jiān)測生產(chǎn)工藝，控制宿主細(xì)胞殘留核酸限度,，以確保產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量已經(jīng)成為監(jiān)管機(jī)構(gòu)和行業(yè)內(nèi)關(guān)注的重點,。

此外,，《中華人民共和國藥典》2020年版第三部規(guī)定，外源性DNA殘留檢測采用DNA探針雜交法,、熒光染色法和定量PCR法,。目前市場上對宿主細(xì)胞殘留DNA檢測，主要采用熒光探針qPCR方法,，qPCR法具有的靈敏度,、序列特異性和準(zhǔn)確性，可為生物制藥工業(yè)在工藝研究和成品質(zhì)量控制方面提供可靠的檢測手段,，現(xiàn)也已成為各生物制品廠家檢測方法,。

翌圣生物自主研發(fā)的CHO宿主細(xì)胞殘留DNA的qPCR法檢測試劑盒，可快速高效檢測生物藥中宿主DNA殘留量,。

圖3. CHO DNA (3G)標(biāo)曲范圍3fg/μL~300pg/μL,，擴(kuò)增效率為99.29%，各濃度檢測值CV<15%

除需對DNA的殘留量進(jìn)行控制外,，DNA殘留片段大小分布也是確定其相關(guān)風(fēng)險因素的重要指標(biāo),。有研究表明，一個功能基因至少在200bp以上,，因此大于200bp可能會有一定的致病性,，且殘留DNA片段越大，生物制品的風(fēng)險等級越高,。

美國FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)》的行業(yè)指南中建議將非致瘤性連續(xù)細(xì)胞的殘留DNA量限制在10 ng/劑以下,，DNA大小限制在約200bp以下。

2022年5月,，國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心（CDE）發(fā)布的體內(nèi)基因治療產(chǎn)品要學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）中也明確指出需對DNA殘留量和殘留片段大小進(jìn)行控制,，建議盡量將DNA殘留片段的大小控制在200bp以下。

目前,，行業(yè)內(nèi)對于殘留宿主細(xì)胞DNA片段分析,，主要是利用毛細(xì)管電泳的方法。研究者們開發(fā)了一種基于毛細(xì)管凝膠電泳與敏感激光誘導(dǎo)熒光（CGE-LIF）檢測殘留DNA分子大小的方法,，可以檢測生物制品中殘留DNA的大小,，實驗表明，大多數(shù)宿主細(xì)胞殘留DNA片段大小為50～2 000bp,。除了毛細(xì)管電泳法外,，實時熒光定量PCR（qPCR）法也被用于進(jìn)行生物制品中生產(chǎn)用細(xì)胞相關(guān)的DNA片段分布的分析,。且qPCR法相比于CGE-LIF操作更簡單，耗時更短,。

針對上述情況,，翌圣生物自主研發(fā)了CHO殘留DNA片段分析試劑盒，采用熒光探針qPCR法原理,，設(shè)計了四種不同的擴(kuò)增片段（94bp,、115bp、252bp,、505bp）,，用于定量檢測樣本中CHO宿主細(xì)胞殘留DNA片段的大小分布情況。

圖4. 宿主細(xì)胞中殘留DNA片段分析檢測流程圖

生物制品中HCP殘留含量通常被認(rèn)為是產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA),，是工藝穩(wěn)健性監(jiān)測的重要評價指標(biāo),，也是產(chǎn)品的重要質(zhì)控指標(biāo)。各國法規(guī)都有涉及HCP的論述,，要求必須對生物藥品進(jìn)行分析和純化,，以將宿主細(xì)胞蛋白HCP降低到可接受的水平。

《中國藥典》三部（2020版）規(guī)定：針對CHO細(xì)胞,，HCP殘留需要<0.05%（相當(dāng)于小于500ppm）,；針對E.coli，HCP殘留需要<0.01%,。

美國藥典USP<1132>章節(jié)規(guī)定：用一種靈敏度較高的方法檢測藥品中的HCP,，其含量應(yīng)該低于檢測限（通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCP含量應(yīng)小于100ng,，也即<0.01%）,。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是目前HCP檢測常用的方法，在2020版《中國藥典》通則3412/3413/3414中提到的宿主蛋白殘留檢測方法均為ELISA法,。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司自主研發(fā)了包括CHO宿主細(xì)胞在內(nèi)的多款HCP蛋白殘留量檢測試劑盒,。試劑盒均采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）的實驗原理，以及生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng),，能夠高靈敏的檢測樣本中HCP殘留量,。試劑盒可以用于生物制品純化工藝過程的優(yōu)化、中間工藝過程的雜質(zhì)控制以及終產(chǎn)品的放行檢測,。

圖5. 翌圣CHO HCP ELISA試劑盒產(chǎn)品特點

金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁中的A蛋白（Staphylococal ProteinA,，SPA）又稱Protein A，是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì),，42kDa，能特異性地與人和哺乳動物抗體（主要是IgG）的Fc區(qū)結(jié)合,，通常在大規(guī)?？贵w制備中用于純化IgG,。在抗體藥生產(chǎn)中，下游親和層析過程中Protein A會不可避免的與目標(biāo)抗體蛋白一起被洗脫下來,，從而在最終純化步驟中產(chǎn)生Protein A殘留,。這種雜質(zhì)會嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量、藥效以及安全性,。因此,，國內(nèi)外法規(guī)對殘留Protein A檢測以及殘留量標(biāo)準(zhǔn)均有相關(guān)文件出臺。

《中華人民共和國藥典》2020年版第三部《人用重組單克隆抗體制品總論》3.2.4 工藝相關(guān)雜質(zhì)中提出“采用適宜的方法對供試品宿主蛋白質(zhì),、宿主細(xì)胞和載體DNA,、蛋白A及其他工藝相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行檢測"。

USP<130> PROTEIN A QUALITY ATTRIBUTES中提到希望廠家能夠在純化工藝中將脫落的protein A清除,，生產(chǎn)工藝也需要進(jìn)行相應(yīng)驗證,。

關(guān)于Protein A檢測方法和殘留限度，2020年版中國藥典三部《尼妥珠單抗注射液》3.1.3.3 蛋白質(zhì)A殘留量中提出“用酶聯(lián)免疫吸附法（通則3429）測定,，蛋白質(zhì)A殘留量應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.001%",。

目前，基于ELISA的殘留檢測基本上已被應(yīng)用于工藝研發(fā)和驗證過程中以確保在蛋白A親和層析之后的過程步驟中能夠有效去除殘留蛋白A,。翌圣自主研發(fā)的Protein A ELISA Kit正是采用ELISA方法,，通過試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品對樣品中的殘留protein A進(jìn)行定量檢測。

圖6. 翌圣生物ELISA法檢測Protein A殘留量的實驗過程