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支原體概念和污染的影響
支原體（Mycoplasma）又稱霉形體,，是目前發(fā)現(xiàn)的最小、無細(xì)胞壁的原核生物,，直徑大小0.1~0.3μm，能通過濾膜且呈高度多形性,，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中相對常見且難以檢測的細(xì)菌污染物,。
支原體污染對細(xì)胞培養(yǎng)造成多方面的不良影響，已經(jīng)成為在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的一個(gè)嚴(yán)重問題,，保守估計(jì)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染率為15~35%,，嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。
細(xì)胞培養(yǎng)中95%的支原體污染主要是由萊氏無膽甾原體,、精氨酸支原體,、口腔支原體、發(fā)酵支原體,、人型支原體,、豬鼻支原體引起的,。支原體在培養(yǎng)基上，形成的菌落呈“煎雞蛋“形狀,。細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞膜適宜支原體生長,，寄生在細(xì)胞表面的支原體可以穿透宿主細(xì)胞膜。
支原體污染來源主要有：細(xì)胞培養(yǎng)液或其成分（如培養(yǎng)基原料,、血清和其他試劑）,、實(shí)驗(yàn)室操作人員、細(xì)胞培養(yǎng)箱,、液氮培養(yǎng)箱,、空氣中的粒子和氣溶膠、抗生素的過度使用,、密封不當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)物和污染了支原體的細(xì)胞等,。
與此同時(shí)，這些污染對應(yīng)的危害為：導(dǎo)致細(xì)胞制品或以細(xì)胞為介質(zhì)進(jìn)行生產(chǎn)的產(chǎn)品在下游純化過程中可能因未能有效去除支原體而造成批次報(bào)廢,、污染其接觸的所有相關(guān)設(shè)備設(shè)施甚至中間或終產(chǎn)品,、導(dǎo)致其他正常細(xì)胞受到支原體污染、導(dǎo)致重要細(xì)胞或病毒種子庫受到支原體污染而報(bào)廢,、導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室整體環(huán)境受到污染而被迫停止生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)操作進(jìn)行支原體去除,、導(dǎo)致支原體產(chǎn)生耐受性而更難以去除、支原體污染面積擴(kuò)大,、對實(shí)驗(yàn)室中的其他細(xì)胞培養(yǎng)物造成威脅,。
因此，定期進(jìn)行支原體檢測和去除,，確保無支原體存在細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)才能保障科學(xué)研究工作的正常進(jìn)行,。
支原體檢測
支原體是一種比較常見但通常難以去除的污染類型，對于涉及細(xì)胞培養(yǎng)的生物制品工藝過程,，法規(guī)要求“必須確保無支原體污染",。
2020年版中國藥典三部《生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制》中提出對于生產(chǎn)用細(xì)胞，需要對主細(xì)胞庫（MCB）,、工作細(xì)胞庫（WCB）,、生產(chǎn)終末細(xì)胞（EOPC）進(jìn)行支原體檢查。
FDA, Guidance for Industry:Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications,，提出對于原材料,、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進(jìn)行支原體控制,。
ICH Q5D《用于生產(chǎn)生物技術(shù)/生物產(chǎn)品的細(xì)胞底物的起源和特征描述》也提到：對于原材料,、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進(jìn)行支原體控制,。
圖1.中外法規(guī)里要求的支原體污染檢測點(diǎn)
傳統(tǒng)的支原體檢測方法主要為培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法,，但由于這兩種方法的檢測周期長或靈敏度問題,，致使企業(yè)生產(chǎn)或產(chǎn)品放行周期拉長。而隨著細(xì)胞基因治療的發(fā)展,，行業(yè)內(nèi)對支原體檢測時(shí)效性和靈敏度要求越來越高,，短的貨架期不足以支撐如此長的檢測周期，因此快檢的NAT方法從眾多支原體檢測方法中脫穎而出,。
圖2.中外法規(guī)里列舉的支原體檢測方法
基于NAT (nucleic acid amplification techniques)核酸擴(kuò)增技術(shù),，翌圣生物開發(fā)了一系列支原體快速檢測的試劑盒，其中包括熒光探針qPCR法支原體檢測試劑盒,、一步恒溫顯色法支原體檢測試劑盒和巢式PCR法支原體檢測試劑盒,。
熒光探針qPCR法支原體檢測試劑盒
是一種快速定性檢測生產(chǎn)原料、細(xì)胞庫,、病毒種子,、病毒或細(xì)胞收獲液、治療用細(xì)胞中潛在支原體污染的產(chǎn)品,，即主要用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的藥物研發(fā),、生產(chǎn)、放行等方面,。
產(chǎn)品資質(zhì)
符合法規(guī)：按照EP2.6.7,、JP G3和USP 63藥典要求驗(yàn)證，符合國際機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn),；
配合審計(jì)：產(chǎn)品生產(chǎn)符合ISO13485質(zhì)量體系標(biāo)準(zhǔn),，有完善的審計(jì)文件；
保障品質(zhì)：試劑盒所需酶原料全自產(chǎn),，且已產(chǎn)業(yè)化,，供貨穩(wěn)定；
技術(shù)經(jīng)驗(yàn)積累：TaqMan法有技術(shù)沉淀,，Kit靈敏度可達(dá)10CFU/mL及以下,；
專注產(chǎn)品性能：Taq酶抗體庫，雙封閉抗體提高了Kit特異性,、靈敏度,、穩(wěn)定性。
產(chǎn)品特點(diǎn)
檢測種類多：優(yōu)化的TaqMan探針可檢測多達(dá)183種支原體,；
操作簡便：樣本制備和檢測總時(shí)長<3h，無需培養(yǎng)法的28天等待,；
靈敏度高：檢測限達(dá)到可以替代直接培養(yǎng)法的10CFU/mL,；
專屬性強(qiáng)：針對16s rRNA設(shè)計(jì)引物探針，不與梭菌,、乳桿菌等親緣關(guān)系物種交叉反應(yīng),；
安全性高：試劑盒內(nèi)陽性對照(PC)無感染性,，消除污染風(fēng)險(xiǎn)；
防干擾強(qiáng)：引入內(nèi)部質(zhì)控(IC),，可排除樣本干擾,、反應(yīng)配制異常等因素，有效避免假陰性,。
圖3.熒光探針qPCR法支原體檢測工作流程
一步恒溫顯色法支原體檢測試劑盒
采用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),，在顏色判別方面具有更強(qiáng)的辨識度，由藍(lán)紫色（陰性）向天藍(lán)色（陽性）變,，更利于肉眼的判別,，增加了防污染組分，杜絕假陽性現(xiàn)象的存在,。
圖4. 一步恒溫顯色法支原體檢測操作流程
巢式PCR法支原體檢測試劑盒
不同于普通的一步法PCR檢測方法,，將原先的1對引物提高至3對引物，針對支原體16s和23s保守區(qū)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增,，在改變產(chǎn)品非特異性的同時(shí)大大提升了產(chǎn)品的靈敏度,，可以檢測低至單個(gè)拷貝的支原體。
圖5.巢式PC法支原體檢測操作流程
支原體去除
在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，定期檢測能夠有效的避免支原體大量污染,，但如果細(xì)胞已受支原體污染，則需對其進(jìn)行及時(shí)處理,，最佳處理原則為將細(xì)胞高壓滅菌后丟棄,，以免污染其它潔凈的細(xì)胞株。若受污染的細(xì)胞比較珍貴,，必須去除支原體污染,，可以通過混合使用抗生素以達(dá)到目的。由于支原體無細(xì)胞壁,，因此傳統(tǒng)的抗生素一般對其無效,。此時(shí)，選擇一款合適的支原體去除試劑尤為重要,。
翌圣生物MycAway™ Treatment (1000×)支原體去除試劑,，是一種混合抗生素制劑，含有三種對支原體具有抑菌作用的組分,，分別是喹諾酮類,、四環(huán)素衍生物類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。該支原體去除試劑可通過抑制DNA和支原體生長所必須的相關(guān)蛋白合成來取得良好的支原體清除效果,，且對細(xì)胞無傷害,，挽救細(xì)胞，減少因支原體污染帶來的損失,。
產(chǎn)品特點(diǎn)
毒性低：對細(xì)胞毒性小,，不影響后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn),，如細(xì)胞轉(zhuǎn)染和活力檢測等；
穩(wěn)定性強(qiáng)：-20℃試劑能較長時(shí)間保存并保持高效用,；
操作簡單：只需將產(chǎn)品添加至支原體污染的培養(yǎng)基中孵育即可,；
起效快：最快3天即可見效；
去除范圍廣：能去除實(shí)驗(yàn)室絕大多數(shù)支原體類型,。
圖6.支原體去除試劑細(xì)胞毒性檢測圖示
支原體預(yù)防
在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，支原體污染常有發(fā)生，但由于其特殊性很難被肉眼和顯微設(shè)備檢測到,，因此做好支原體的預(yù)防工作顯得尤為重要,。可通過向培養(yǎng)基中添加支原體預(yù)防試劑,，來有效預(yù)防支原體的污染,。
目前實(shí)驗(yàn)室支原體主要來自于：細(xì)胞間的交叉污染、工作環(huán)境或者實(shí)驗(yàn)器材的污染,、實(shí)驗(yàn)者無菌操作不佳,、污染的培養(yǎng)基或者試劑、帶有支原體污染的原始組織或者器官等,。翌圣生物開發(fā)的支原體預(yù)防系列產(chǎn)品,，具有操作簡單、方便,、穩(wěn)定性好等特點(diǎn),，非常適合日常細(xì)胞系培養(yǎng)中支原體預(yù)防。
產(chǎn)品信息
