T4噬菌體基因32編碼蛋白(T4 gene 32 protein,，gp32)是一種單鏈DNA（ssDNA）結(jié)合蛋白，為T4噬菌體DNA復(fù)制和修復(fù)所必需。它被廣泛地用于穩(wěn)定和標(biāo)記ssDNA區(qū)域,，以便用電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)DNA的結(jié)構(gòu),、促進(jìn)限制性內(nèi)切酶的消化反應(yīng)、提高RT-PCR中反轉(zhuǎn)錄的效率,、增強(qiáng)T4 DNA聚合酶的活性和提高PCR的產(chǎn)量等,。
T4 gene 32 protein的結(jié)構(gòu)T4 gene 32 protein由301個(gè)氨基酸組成，大小為34 kDa,，包含三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：核心結(jié)構(gòu)域,、N端結(jié)構(gòu)域（NTD）和C端結(jié)構(gòu)域（CTD）。核心結(jié)構(gòu)域：包含ssDNA的結(jié)合位點(diǎn),，并具區(qū)分單鏈,、雙鏈DNA的能力；
C端結(jié)構(gòu)域（CTD）：涉及異型蛋白相互作用,，帶負(fù)電荷,，調(diào)節(jié)gp32與復(fù)制、修復(fù)和重組機(jī)制中其他成分的相互作用,；
N端結(jié)構(gòu)域（NTD）：負(fù)責(zé)同型蛋白相互作用,，帶正電荷，與鄰近的gp32單體的核心結(jié)構(gòu)域之間通過蛋白-蛋白接觸,，使gp32蛋白以頭-尾方向結(jié)合ssDNA,。
T4 gene 32 protein介導(dǎo)的DNA重組修復(fù)DNA損傷時(shí)，后隨鏈合成岡崎片段,，gp32與前導(dǎo)鏈結(jié)合當(dāng)前導(dǎo)鏈聚合酶(紅色)在DNA損傷處（X）停滯時(shí),，前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成會(huì)解耦聯(lián)，后隨鏈的合成機(jī)制可以合成與受損部位重疊的岡崎片段(綠線),，同時(shí)會(huì)在停滯的前導(dǎo)鏈聚合酶前面打開一個(gè)ssDNA缺口，該缺口被gp32覆蓋(橙色),；
gp32單體簇通過阻止Dda解旋酶加載到后隨鏈上來阻止其對復(fù)制叉移動(dòng)的刺激,，并促進(jìn)模板子鏈3 '端的解旋；
模板轉(zhuǎn)換恢復(fù)復(fù)制叉移動(dòng)
UvsX重組酶和Dda解旋酶催化模板轉(zhuǎn)換來恢復(fù)停滯的復(fù)制叉,；
進(jìn)行后續(xù)無錯(cuò)誤的跨損傷DNA合成,。
圖2. gp32介導(dǎo)的重組修復(fù)過程[2]
T4 gene 32 protein應(yīng)用（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）該技術(shù)可以在37~42 ℃條件下實(shí)現(xiàn)待測靶標(biāo)的快速檢測,，具有反應(yīng)靈敏度高,、特異性強(qiáng)、對儀器依賴程度低且可整合多種檢測模式等優(yōu)點(diǎn),，特別適用于基層和現(xiàn)場即時(shí)檢測,，可廣泛應(yīng)用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全,、生物安全,、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。
圖3. 重組酶聚合酶擴(kuò)增RPA技術(shù)擴(kuò)增原理圖[3]
重組酶T4 UvsX在ATP的參與和定位因子（T4 UvsY）的幫助下與擴(kuò)增引物結(jié)合形成重組酶引物復(fù)合體,，并在雙鏈DNA中尋找同源序列,；
重組酶引物復(fù)合體一旦定位到同源序列，則會(huì)插入雙鏈DNA形成D-環(huán)結(jié)構(gòu),，啟動(dòng)鏈置換反應(yīng),，單鏈結(jié)合蛋白gp32會(huì)與解開的DNA鏈結(jié)合防止進(jìn)一步被置換；
重組酶T4 UvsX從重組酶引物復(fù)合體中被水解,，3'端引物暴露并與Bsu DNA聚合酶結(jié)合,，DNA開始復(fù)制延伸，最終兩條母鏈分離,，形成兩條新的互補(bǔ)雙鏈DNA,。該反應(yīng)在37-42℃下進(jìn)行，可在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列1012倍的擴(kuò)增,。
（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification,，NASBA）該技術(shù)由一對引物介導(dǎo)，反應(yīng)在42℃進(jìn)行,，可在2 h左右將模板RNA擴(kuò)增約109～1012倍,，不需特殊的儀器，具有較高的特異性和靈敏度,。廣泛應(yīng)用于病毒,、細(xì)菌、霉菌,、寄生蟲和細(xì)胞因子等的檢測,，特別是用于艾滋病病毒、丙肝肝炎病毒等RNA病毒的檢測當(dāng)中,。在動(dòng)物疫病預(yù)防控制方面,，NASBA方法已成為診斷病毒的國家診斷標(biāo)準(zhǔn)方法之一（GB/T19440-2004 病毒NASBA 檢測方法）。
在NASBA中加入gp32,，可以穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄形成的單鏈cDNA,，減少NASBA中對熱退火步驟的依賴，提高NASBA程序的簡單性,。
1）PCR擴(kuò)增中,，使用gp32可以顯著地提高片段的擴(kuò)增長度及產(chǎn)量[5]，并減輕血紅素,、腐殖酸等抑制物的對PCR擴(kuò)增的抑制作用[6],。如圖5所示，將濃度的抑制劑加入含有5 pg模板DNA的反應(yīng)混合物中，另外在不添加抑制劑的情況下,，檢測0.05,、0.5和5 pg模板DNA的擴(kuò)增情況。結(jié)果顯示在PCR體系種添加gp32可顯著減輕抑制劑對PCR擴(kuò)增的抑制,。
圖5. T4 gene 32 protein解除抑制劑對PCR的干擾[6],。A：不含gp32的標(biāo)準(zhǔn)PCR條件；B：含有150 ng/mL gp32的PCR條件
2）Gp32通過阻止模板ssDNA和RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成,，分別增強(qiáng)T7 RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的活性,，從而增加體外轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)量[7]。
翌圣的T4 gene 32 protein由ZymeEditor酶改造平臺(tái)重組表達(dá)而來,，蛋白純度高,，核酸酶殘留水平低，批次間穩(wěn)定性優(yōu)異,，宿主DNA殘留水平極低,，適用于RPA、NASBA技術(shù),、PCR,、NGS文庫構(gòu)建等應(yīng)用。
圖5.客戶測試翌圣重組酶聚合酶核心酶原料擴(kuò)增結(jié)果圖
注：2,、4為陽性實(shí)驗(yàn)組,；1、3為陰性對照組
客戶采用翌圣Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL),、T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL),、T4 UvsY protein (2 μg/μL)、T4 gene 32 protein (gp 32),、肌酸激酶Creatine Kinase (2 μg/μL) 進(jìn)行RPA擴(kuò)增反應(yīng),，得到正確的目的條帶，且條帶清晰,、明亮,，結(jié)果表明，翌圣重組酶聚合酶擴(kuò)增核心酶原料可實(shí)現(xiàn)高效RPA等溫?cái)U(kuò)增,。
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品作用 |
Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL) | 11078ES | 結(jié)合引物與原始靶核酸序列互補(bǔ)合成新的DNA模板 |
T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL) | 11079ES | 具有配對和鏈轉(zhuǎn)移活性的重組酶 |
T4 UvsY protein (2 μg/μL) | 11080ES | 重組酶輔助因子，刺激T4 UvsX的單鏈DNA依賴性ATP酶活性并降低活性所需的T4 UvsX臨界濃度 |
T4 gene 32 protein (gp 32) T4噬菌體基因32編碼蛋白 | 11081ES | 參與DNA復(fù)制,、修復(fù),、重組與解鏈后的單鏈DNA結(jié)合，防止自雜交 |
Creatine Kinase (2 μg/μL) 肌酸激酶 | 14502ES | 刺激ATP和肌酸分解為磷酸肌酸和ADP,，釋放能量 |
Exonuclease III (100 U/μL) | 14525ES | 具有3’→5’外切酶活性,，切斷熒光探針中淬滅基團(tuán)，釋放熒光 |
初級(jí)會(huì)員·13年
