定向進(jìn)化主要包括文庫構(gòu)建與突變體篩選兩部分，關(guān)鍵點(diǎn)則在于建立基因型和表型（即突變體性能）之間的物理對應(yīng)關(guān)系,。前兩期,，我們已經(jīng)介紹了酶定向進(jìn)化的突變體文庫構(gòu)建技術(shù)和突變體篩選技術(shù)，今天小翌來介紹基因型與表型的關(guān)聯(lián),。高效篩選方法的前提在于建立可靠的基因型和表型的關(guān)聯(lián),，這涉及兩個層面：首先符合預(yù)期表型的突變體的基因型可被回溯，即建立氨基酸序列和基因信息之間的聯(lián)系,；其次,，突變體相比于親本的表型變化能被設(shè)備或肉眼捕捉，最好能夠量化展示突變體性能提升的程度,。
依賴物理空間或分子互作的直接關(guān)聯(lián)突變體的遺傳物質(zhì)和蛋白存在物理聯(lián)系的關(guān)鍵在于將二者鎖定在固定的空間內(nèi),，酶反應(yīng)引起的物化性質(zhì)變化作為篩選的依據(jù)，同一空間內(nèi)的遺傳物質(zhì)則作為突變體酶的分子標(biāo)簽,。體內(nèi)篩選所用的微生物細(xì)胞是天然存在的的物理空間,，符合期望的表型能直接回溯到相應(yīng)基因型，并直接獲得可持續(xù)繁殖的個體,。CSR,、FADS技術(shù)中的微液滴則是在細(xì)胞外再構(gòu)造了一層物理屏障，確保細(xì)胞破碎后其DNA和蛋白依然共存,。而對于以無細(xì)胞反應(yīng)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的液滴篩選技術(shù)（圖1）,，缺少了微生物這個“內(nèi)包裝"，均相溶液中核酸（mRNA或DNA）和蛋白則只能依賴分子間的相互作用而直接偶聯(lián)（如依賴嘌呤霉素和嘌呤霉素連接子建立聯(lián)系）,，形成類似mRNA-核糖體-蛋白三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu),，確保酶和相應(yīng)的核酸一一對應(yīng)。
依賴克隆編碼及備份的間接關(guān)聯(lián)另一類方式則是將突變體單克隆預(yù)先備份,，突變體酶性能評價結(jié)束后通過試管編號回溯到相應(yīng)的種子液,，進(jìn)行再培養(yǎng)和后續(xù)測試。而在液滴技術(shù)領(lǐng)域,，隨著設(shè)備準(zhǔn)確度,、速度、智能化程度的提升,，液滴編碼標(biāo)記和單液滴分離技術(shù)也將可以實(shí)現(xiàn)FADS系統(tǒng)中的液滴的備份,。
圖1. 酶反應(yīng)過程監(jiān)測
（圖片來自：doi: 10.1016/j.tibtech.2020.01.001）
高效檢測讓篩選事半功倍！
酶的種類千差萬別，不同酶又有多樣化的性能提升需求,，因此定向進(jìn)化篩選的標(biāo)準(zhǔn)是需要精確、客觀,、容易量化的,，最重要的是性能變化能直接或間接地被鑒別。
在體內(nèi)篩選系統(tǒng)中,，參與轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的酶蛋白的性能變化能夠轉(zhuǎn)化為報告基因的水平差異,，如涉及轉(zhuǎn)錄的甲基化酶、RNA聚合酶,、轉(zhuǎn)錄因子（圖1c1）,、調(diào)控因子，涉及翻譯的核酶,、tRNA及tRNA合成酶,。此外，一些轉(zhuǎn)錄因子需要與特定的代謝中間產(chǎn)物協(xié)同作用（如LacZ和半乳糖,、AraC和阿拉伯糖）,，這些小分子涉及的代謝途徑相關(guān)酶，也有潛力在報告基因的基礎(chǔ)上建立胞內(nèi)篩選體系,。核糖開關(guān)是一段特殊的RNA序列,，可在小分子的誘導(dǎo)下發(fā)生二級結(jié)構(gòu)的改變，這類小分子同樣可以關(guān)聯(lián)到特定的代謝途徑,，以核糖開關(guān)下游的報告基因的表達(dá)情況指示途徑中酶的性能變化（圖1c3,、圖1c4）。
產(chǎn)物是最佳的酶反應(yīng)標(biāo)志物,，在體外篩選體系中,，產(chǎn)物可直接用質(zhì)譜設(shè)備進(jìn)行定量（圖1e），或監(jiān)測產(chǎn)物積累引起的反應(yīng)液濁度,、pH,、電勢、熒光強(qiáng)度的變化（圖1a&d）,。然而,，在高通量篩選時體系內(nèi)的信號常會受到細(xì)胞碎片和內(nèi)容物的干擾，微液滴內(nèi)極低的產(chǎn)物總量也會對設(shè)備的靈敏度帶來較大考驗(yàn),。因此,，一些特異性識別、標(biāo)記技術(shù)和級聯(lián)放大策略被用于輔助突變體的篩選,。適配體是一段核酸序列（DNA或RNA）,，折疊為特殊的二級結(jié)構(gòu)即可特異性識別并結(jié)合目標(biāo)分子，甚至通過形成穩(wěn)定的復(fù)合物而激發(fā)熒光（圖1c5），特征性地被設(shè)備識別進(jìn)而提高檢測的特異性和靈敏度,。適配體也可以作為RNA聚合酶的反應(yīng)物,，直接指示突變體的活性（圖2）。應(yīng)用于DNA產(chǎn)物檢測的標(biāo)記基團(tuán)則可通過多種組合方式測試聚合酶,、連接酶,、限制性內(nèi)切酶的活性，底物結(jié)構(gòu)或完整度的變化而引起的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)空間距離的變化,，讓熒光基團(tuán)有潛力發(fā)出熒光而被設(shè)備捕獲（圖3）,。
圖2. RNA適配體
（圖片來自：doi: 10.1016/j.saa.2022.121760.）
圖3. FRET定量檢測DNA
（圖片來自：doi: 10.1021/acssynbio.9b00103.）
DNA的序列組成決定了酶蛋白的一級結(jié)構(gòu)與催化性能，優(yōu)勢突變體與相應(yīng)基因型的物理聯(lián)系則是人們最終破譯氨基酸序列的關(guān)鍵,。至少在高效,、便捷的蛋白質(zhì)測序技術(shù)出現(xiàn)之前，核酸和蛋白的一對一關(guān)聯(lián)對酶的定向進(jìn)化來說是的,。到這,，酶定向進(jìn)化的突變體文庫構(gòu)建技術(shù)、突變體篩選技術(shù),、基因型與表型的關(guān)聯(lián)已經(jīng)介紹完了,。總之,，超高通量篩選對于充分發(fā)揮定向進(jìn)化的潛力至關(guān)重要,，但目前與高效篩選（即快速、準(zhǔn)確,、靈敏）相匹配的信號放大策略及設(shè)備的開發(fā)仍有巨大的提升空間,。相信隨著酶反應(yīng)機(jī)理及檢測技術(shù)研究的不斷推進(jìn)，未來定向進(jìn)化的技術(shù)將能夠更快實(shí)現(xiàn)迭代,。
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