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熒光定量PCR是實驗室中出鏡率非常高的一種檢測方法,。該方法通過在PCR體系中添加熒光基團來記錄DNA產物的累積情況,，從而達到對PCR過程進行實時監(jiān)控的目的,，并且可以通過數據分析計算出起始模板量,，這就是“熒光定量"中“定量"一詞的來源,。
熒光定量PCR實驗因為靈敏度高所以經常是差之毫厘謬以千里,，所以在實驗過程中,，我們需要注意諸多細節(jié)，謹慎操作,。小伙伴們看到這里就要著急了,，我怎樣才能做好qPCR實驗，拿到實驗結果,，發(fā)表高分文章,？
在進行熒光定量實驗時，我們通常會接觸并使用三種圖表,，分別是擴增曲線,、標準曲線還有熔解曲線。曲線中出現(xiàn)的圖形分別代表著什么,？對我們的實驗結果有什么幫助,？類似于熒光閾值,、擴增效率、Tm值定義是什么,？發(fā)揮著什么樣的作用等等,？了解這些元素背后的意義,，將有助于我們設計實驗方案,、后續(xù)系統(tǒng)分析實驗結果~
在熒光定量PCR實驗進程中，熒光定量PCR儀會對整個PCR反應擴增過程進行實時的檢測并記錄熒光信號,，隨著反應循環(huán)數的增加,，記錄的熒光信號也不斷的累積,。熒光定量PCR擴增曲線便是一條以循環(huán)數為橫坐標和熒光強度變化為縱坐標的熒光曲線。通常見到的熒光定量PCR擴增曲線會有兩種展現(xiàn)形式,，分別是對數圖譜和線性圖譜,，其中會包括基線、熒光閾值,、CT值,、指數增長期等。
基線是指初始PCR的最初幾個循環(huán)中(通常為第3 至15個循環(huán))的信號水平,，此階段的熒光信號變化極小,。低水平的信號相當于PCR反應的背景或“噪聲"。該背景信號通常主要來自于反應管中的反應體系,，隨著反應的不斷進行,，累積的熒光信號會超過背景信號，從而進入下一時期,?；€期通常情況下由儀器自動劃定。
隨著PCR“一生二,，二生四,，四生八"的指數型擴增，熒光信號也呈現(xiàn)相應的指數型的熒光信號積累,。該時期所有反應試劑均有盈余,，DNA聚合酶仍保持著高水平的活力，擴增產物也相對較少,，不會競爭引物的結合作用,。該時期的PCR反應具有高度特異性和精確性，只有在這個時期Ct值和初始模板量之間存在線性關系,，故該時期也于定量分析,。
理想的PCR反應方程：Xn = X0*2n
現(xiàn)實的PCR反應方程：Xn = X0* (1+En)n
（備注：n表示擴增反應的循環(huán)數，X0表示初始模板量，Xn表示第n次循環(huán)后的產物量,，En表示擴增效率）
在指數增長期時,，En是一個固定值(理想狀態(tài)下100%)，其中的變量只有初始模板量X0和循環(huán)數,，方便計算,。
隨著原料的消耗、產物的積累,、酶活的損耗等,，DNA的擴增不再呈指數擴增，熒光信號的增長也逐漸放緩,。
由于底物耗盡,，酶活性降低等因素，熒光信號不再呈指數型增加,，趨于平穩(wěn),。在實際操作過程中，由于每個反應孔中的每個樣品可能具有不同的反應動力學,，每個反應孔進入平臺期的時間點會有所不同,，最終的產物含量也各不相同。
熒光定量PCR儀通常將熒光閾值自動設置為基線期熒光值標準差的10倍,。其存在的目的主要是將相關擴增信號從背景中區(qū)分出來,，從而用于定量計算。熒光閾值遇到特殊情況可以手動調整,，但務必保證閾值線與擴增曲線的交點位于指數增長期,。
CT值表示每個反應管內熒光信號到達設定的熒光閾值時所經歷的循環(huán)數。在擴增曲線圖上顯示為擴增曲線與熒光閾值線交叉點所對應的橫坐標,。CT值可用于計算起始DNA拷貝數,，研究顯示，CT值與靶標的起始量成反比,，起始量約多，CT值約小,，反之亦然,。靶標起始量之間的差別通常可以通過CT值粗略估算出來,。靶標起始量差了2倍的情況下,，CT值的差異通常為1左右(21=2)；靶標起始量差了10倍的情況下,，CT值的差異通常為3.33左右(23.33=10),。
通常情況下將已知濃度的樣品(市面上購買的標準品或自己構建的質粒)經過梯度稀釋后分別取樣進行熒光定量PCR，得到一系列的CT值，以已知的稀釋梯度的濃度的對數作為橫坐標,，濃度所對應的CT值為縱坐標繪制曲線,，即可得到一個標準曲線。通過標準曲線中的一些參數,，可用于判斷相關實驗樣本同樣靶標的起始量或者評估反應效率,。
R2值又稱為擬合優(yōu)度，通常用來描述數據對模型擬合程度的好壞,，表示橫坐標自變量對縱坐標因變量的解釋程度,。理論上，R2要等于1,，熒光定量實驗中越接近1表示回歸擬合效果越好,，一般熒光定量PCR標準曲線至少要求0.98以上。
標準曲線的斜率可用于檢測擴增效率,。通常情況下,，為了獲得準確且可重現(xiàn)的結果，反應的效率需盡可能接近100%,，相當于-3.32的斜率,。當反應的效率在90%-110%時，相當于-3.58至-3.10的斜率,。
正如上方斜率所提到的,，擴增效率可用斜率來進行計算。計算方程為：
效率 = 10（–1/斜率） – 1
理論上,，在指數擴增循環(huán)中,，PCR產物是2倍增加，反應效率為100%,，由100%=10（–1/斜率） – 1可推算標準曲線斜率為-3.32,，良好的擴增效率需在90%至110%之間，其對應的斜率在-3.58至-3.10之間,。實際操作時,，若擴增效率低于90%，則表明擴增效率偏低,，偏低原因可能來自于引物設計不當,，或者反應條件未優(yōu)化；若擴增效率高于100%,，可能是梯度稀釋樣品加樣錯誤,，或者出現(xiàn)類似引物二聚體的的非特異產物擴增。當擴增效率不在90%至110%之間時,，建議重新設計引物或探針,。
上圖顯示了不同擴增效率的熒光定量PCR反應，該反應初始模板量均為1拷貝。數據顯示擴增效率差異在PCR反應早期不會造成太大的影響,。但隨著反應的進行,，在30個循環(huán)后，100%擴增效率所得到的產物和擴增效率為70%所得到的產物之間存在131倍的數量差異,。因此,，在循環(huán)次數相對較多且需要精確測試的實驗中，保證好的擴增效率尤為重要,。
熔解曲線通常出現(xiàn)在染料法熒光定量PCR中,，在擴增階段，染料分子會結合于DNA雙螺旋的小溝區(qū)域,，發(fā)出較強的熒光信號,。而在熔解曲線階段，隨著反應溫度的不斷升高,，結合染料分子的雙鏈DNA會解離成單鏈DNA,，染料分子脫離DNA，熒光信號減弱,。當到達雙鏈DNA解鏈溫度Tm時(即DNA雙鏈解鏈一半時),，熒光信號急劇下降。以熒光強度和溫度或熒光變化和溫度變化作圖,，即可清晰顯示熔解曲線的動態(tài)變化,。左圖為熒光和溫度作圖得到的原始熔解曲線，右圖為將溫度與熒光信號的變化求導作圖(-dI/dT),，得到的熔解曲線,。通常使用右圖的熔解曲線進行分析更加簡便直接。
熔解曲線分析是一種簡單,、直接的分析方法,，可用于分析熒光定量PCR反應中的引物二聚體、其他非特異性擴增等等,，以確保反應的特異性,。DNA的解鏈溫度Tm受DNA長度、GC含量以及是否存在錯配堿基等因素的影響,，因此還可以通過熔解曲線區(qū)分不同的PCR產物,，不用再花時間和精力進行凝膠電泳分析。
以上是對熒光定量PCR相關圖表的介紹,，相信小伙伴們通過小翌的介紹,，今后在實驗圖表上分析具體實驗情況更有把握啦,。關于如何做好qPCR實驗,，小翌會陸續(xù)在公眾號里傳授秘籍噠，敬請期待哦。
方法 | 分類 | 產品名稱 | 貨號 |
RNA提取 | 同Trizol提取 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent | 10606ES |
動物組織/細胞總RNA提取,，避開有毒試劑,，最快15 min完成 | MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細胞/組織總RNA提取試劑盒 | 19221ES | |
簡單植物總RNA提取，避開有毒試劑,，最快40min完成 | MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒 | 19291ES | |
多糖多酚植物總RNA提取,，最快30min完成 | MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒 | 19292ES | |
細胞總RNA提取，避開有毒試劑,，最快8 min完成 | MolPure® Cell RNA Kit 培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒 | 19231ES | |
qPCR染料法 | 高靈敏通用型定量預混液(染料法) | Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | 11184ES |
定量預混液 (染料法),，已發(fā)文章累計IF達到5000+ | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11201ES | |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11202ES | ||
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11203ES | ||
高靈敏型qPCR預混液（染料法） | Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11198ES | |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11199ES | ||
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11200ES | ||
miRNA加A法高特異性定量預混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（加A法） | 11171ES | |
miRNA莖環(huán)法高特異性定量預混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（莖環(huán)法） | 11170ES | |
高靈敏一步法反轉定量試劑盒(染料法) | Hifair® III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit | 11143ES | |
細胞直擴RT-qPCR，1.5 h從細胞到基因表達分析(染料法) | Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit | 11172ES | |
反轉錄試劑 | 5 min快速反轉,，最長可滿足14 kb cDNA合成,，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-示蹤版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11149ES |
5 min快速反轉，最長可滿足14 kb cDNA合成,，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-常規(guī)版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye） | 11150ES | |
15 min一步完成gDNA去除與反轉錄(下游應用qPCR) | Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR | 11142ES | |
高鏈cDNA合成預混液,，含gDNA去除(下游應用qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES | |
最長可滿足19.8 kb cDNA合成試劑盒，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) | 11139ES | |
常規(guī)30 min反轉預混液,含gDNA去除（下游應用qPCR） | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11123ES | |
miRNA反轉錄試劑盒（加A法） | Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法） | 11148ES |
