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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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護(hù)航全流程！宿主核酸殘留去除與檢測(cè)完整方案
近年來(lái),，生物制品已應(yīng)用到生物醫(yī)藥,、生物農(nóng)業(yè),、生物能源、生物制造、生物環(huán)保等多種領(lǐng)域,。隨著生物制品的市場(chǎng)占比越來(lái)越大，針對(duì)生物制品，國(guó)家和相關(guān)部門(mén)也建立起規(guī)范的質(zhì)量管理體系和標(biāo)準(zhǔn),，其中宿主細(xì)胞核酸殘留問(wèn)題是備受關(guān)注的焦點(diǎn)之一,。
生物制品如重組蛋白藥、抗體藥、疫苗,、細(xì)胞與基因藥物等產(chǎn)品是用連續(xù)傳代的菌種株/細(xì)胞株表達(dá)的,，因而產(chǎn)品內(nèi)可能會(huì)殘存宿主核酸。殘留的宿主細(xì)胞核酸可能引發(fā)細(xì)胞因增殖失控變?yōu)槟[瘤細(xì)胞,，也有可能存在感染性病毒基因從而加劇體內(nèi)免疫反應(yīng),。為了規(guī)避上述不良后果，從生物制品安全角度和科研需求的層面,，進(jìn)行有效的核酸殘留去除與嚴(yán)格的殘留檢測(cè)是非常重要的,。
我國(guó)參照WHO、FDA和歐盟的標(biāo)準(zhǔn),，在藥典中明確規(guī)定酵母,、大腸桿菌表達(dá)的生物制品中的DNA殘留量不超過(guò)10ng/劑，CHO和Vero細(xì)胞表達(dá)的EPO,、狂犬疫苗,、乙肝疫苗等不超過(guò)100或10pg/劑。
在核酸殘留去除工作中,，由于DNA帶有大量的電荷與其他生物大分子結(jié)合從而產(chǎn)生聚集（吸附）,、包裹作用而難以除去。傳統(tǒng)的方法均存在核酸殘留去除不凈,、工作量大,、耗時(shí)長(zhǎng)等缺陷，全能核酸酶則可解決此類(lèi)難點(diǎn),。
全能核酸酶,，又稱(chēng)非限制性核酸內(nèi)切酶，是一種來(lái)源于Serratia Marcescen的非特異性核酸內(nèi)切酶,。無(wú)論是實(shí)驗(yàn)研究，還是工業(yè)生產(chǎn),，全能核酸酶都是目前能夠同時(shí)有效去除DNA和RNA的酶,。翌圣生物UCF.ME®核酸酶在GMP條件下生產(chǎn)，可高效去除各種樣品中的核酸雜質(zhì),，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,。
翌圣生物UCF.ME®核酸酶可降解無(wú)論是單鏈、雙鏈,、線性,、圓形還是超螺旋形式的DNA及RNA，無(wú)堿基偏好性,。UCF.ME®核酸酶具有的核酸酶活性以及的耐受性,，可適用于多種操作環(huán)境，能夠在非常廣泛的條件下（6 M Urea，0.1 M Guanidine HCl,，0.4% Triton X-100,，0.1% SDS，1 mM EDTA,，1 mM PMSF）,，短時(shí)間內(nèi)就使樣品中所有的游離核酸降解成長(zhǎng)度為2-5個(gè)堿基的長(zhǎng)度的5'-單磷酸寡核苷酸。后續(xù)也可以通過(guò)相應(yīng)的方法去除UCF.ME®核酸酶,，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn),。
※可以降解所有形式的DNA和RNA；
※核酸酶活性,，樣品中的核酸殘留經(jīng)過(guò)短時(shí)間處理就能降低到皮克級(jí)別,；
※穩(wěn)定性高，耐受性強(qiáng),，適應(yīng)各種操作條件,；
※無(wú)動(dòng)物源性、無(wú)抗生素,；
※GMP條件生產(chǎn),，滿(mǎn)足從研發(fā)到生產(chǎn)的大規(guī)模使用需求；
※審計(jì)資料齊全,，產(chǎn)品申報(bào)無(wú)憂(yōu),。
為了測(cè)試產(chǎn)品的使用性能，我們分別測(cè)試了2種溫度條件宿主DNA殘留（GAPDH/Actin）和質(zhì)粒DNA殘留情況（Bla）,，結(jié)果顯示Yeasen UltraNuclease降解DNA的效率與M公司相當(dāng),。（注：測(cè)試樣本為：HEK293+慢病毒質(zhì)粒）
針對(duì)UltraNuclease，我們還進(jìn)行了使用條件的測(cè)試,。測(cè)試結(jié)果如下表,。隨著核酸酶使用濃度的升高，所需處理時(shí)間成倍性縮短,。針對(duì)Mg2+濃度,、pH、溫度,、DTT,、巰基乙醇、單價(jià)陽(yáng)離子,、磷酸根離子等的最適濃度條件和有效條件我們均作了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臏y(cè)試,。UltraNuclease的耐受性強(qiáng)。
考慮到不同生產(chǎn)或研究過(guò)程中涉及眾多的因素有可能會(huì)影響UltraNuclease的穩(wěn)定性,，我們測(cè)定了9大常見(jiàn)因素對(duì)酶活的影響,。在實(shí)際的研究中可以根據(jù)自身反應(yīng)工藝結(jié)合我們的測(cè)試數(shù)據(jù)做更加適合的體系優(yōu)化,，更大限度的滿(mǎn)足各類(lèi)特殊需求。
酶類(lèi)產(chǎn)品通常需要非常嚴(yán)格的運(yùn)輸條件,、儲(chǔ)存條件和凍融次數(shù)限制,。我們測(cè)試了不同溫度條件下該酶的酶活變化情況、反復(fù)凍融次數(shù)對(duì)酶活的影響以及干冰運(yùn)輸對(duì)酶活的影響,。結(jié)果顯示,，-20℃條件下酶活8周均穩(wěn)定；4℃條件下4周內(nèi)酶活僅降低20%,；37℃條件下酶活可穩(wěn)定2周,。另外再-80至25℃之間凍融10次該酶也表現(xiàn)出較好的酶活特性；冰袋+干冰運(yùn)輸酶活不受影響,。
FDA備案
生產(chǎn)流程嚴(yán)格參照ISO9001/GMP的標(biāo)準(zhǔn),，符合GMP生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)
符合藥物IND申報(bào)要求
無(wú)動(dòng)物源性、無(wú)抗生素：使用植物源性和化學(xué)合成原料發(fā)酵生產(chǎn),，發(fā)酵過(guò)程中不添加抗生素
全能核酸酶去除樣本核酸殘留后不免有引入全能核酸酶的影響,，針對(duì)上述情況，Yeasen也提供了相應(yīng)的檢測(cè)方案——UCF.ME® UltraNuclease Elisa Kit,。該試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)（夾心ELISA）原理檢測(cè)變性與非變性的UCF.ME® Ultra Nuclease全能核酸酶的殘留,，用抗UCF.ME®Ultra Nuclease的兔多克隆抗體包被微孔板，形成固相抗體,，向固相抗體微孔板中加入U(xiǎn)CF.ME®Ultra Nuclease標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品,，然后加入生物素（Biotin）標(biāo)記的Anti-Ultra Nuclease多抗，最后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（SA-HRP）,，形成抗體+ 抗原+抗體-Biotin+SA-HRP復(fù)合物,，經(jīng)過(guò)洗滌后加入TMB底物顯色；TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)換成黃色,，顏色的深淺與樣品中UCF.ME®Ultra Nuclease的量呈正相關(guān),。本試劑盒檢測(cè)定量范圍0.047-3 ng/mL；檢測(cè)下限：23.5 pg/mL,。
