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轉(zhuǎn)染效率低？小翊手把手教你做轉(zhuǎn)染實驗

細胞膜是由磷脂雙分子層和鑲嵌蛋白組成的,，帶有負電荷,。因此帶有負電荷的DNA或RNA無法通過細胞膜。為了讓核酸（DNA或RNA）通過細胞膜,，研究人員利用不同的方法,，包括使用化學物質(zhì)和包被核酸的載體分子進行中和，以及在細胞膜上開孔等物理方法,，將核酸（DNA或RNA）直接運輸?shù)郊毎麅?nèi),。這些就是轉(zhuǎn)染的過程，轉(zhuǎn)染的目的是促進蛋白合成,，調(diào)節(jié)基因表達,，促進細胞生長與發(fā)育等，目前越來越多地被用到功能研究中,。

圖1 DNA/RNA轉(zhuǎn)染過程（圖片來源：圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

1.常見轉(zhuǎn)染方法

根據(jù)導入的核酸在目的細胞中存活時間的長短,，可以將轉(zhuǎn)染技術(shù)分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。也可以根據(jù)轉(zhuǎn)染方式的不同,，分為化學轉(zhuǎn)染,，物理轉(zhuǎn)染、和生物轉(zhuǎn)染方法,。例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,、陽離子聚合物PEI轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn),、顯微注射,、以及慢病毒包裝轉(zhuǎn)染等等。

但是,，沒有一種轉(zhuǎn)染試劑可以滿足所有的實驗要求,。必須根據(jù)您的細胞類型（原代細胞、貼壁細胞,、懸浮細胞）,、外源核酸種類（DNA、RNA）,、基因表達時間,、細胞毒性、轉(zhuǎn)染效率等,，操作是否簡便等因素,，挑選出///理想的轉(zhuǎn)染試劑,。

 圖2不同轉(zhuǎn)染方法的原理和優(yōu)點

在轉(zhuǎn)染過程中，即使選對了合適的轉(zhuǎn)染試劑,，還是不可避免會出現(xiàn)各種令人頭疼的問題,，例如，轉(zhuǎn)染效率低,，細胞死亡,，重復性差等問題。對于這些問題,，我們接下來會詳細剖析,。

2.轉(zhuǎn)染效率低

2.1轉(zhuǎn)染前

1）核酸純度不夠，比如DNA/RNA不純,、質(zhì)粒中含有內(nèi)毒素,、核酸不完整、核酸濃度過低均會導致轉(zhuǎn)染效率低,。建議使用高純度的DNA或RNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率,。

2）要檢測所用的無血清培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)染試劑的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 與轉(zhuǎn)染試劑不相容,。

3）用了含有血清的培養(yǎng)基制備轉(zhuǎn)染復合物,。血清會降低復合物的形成。建議用無血清培養(yǎng)基稀釋DNA/RNA和轉(zhuǎn)染試劑,。

4）DNA或RNA的復合物形成的比例,，一般DNA（µg）：轉(zhuǎn)染試劑（µL）=1:2~1:3；而RNA（ng）：轉(zhuǎn)染試劑（µL）=9:1~3:1,。

5）復合物孵育時間過短,，未能充分形成復合物。建議復合物孵育時間10~20 min,。

6）轉(zhuǎn)染試劑保存不當,，降低轉(zhuǎn)染效率。保存在4 ºC冰箱,，不可凍存,，避免反復長時間開蓋。

2.2轉(zhuǎn)染時

7）細胞密度過低或過高,。DNA轉(zhuǎn)染細胞密度90%~95%,，RNA轉(zhuǎn)染細胞密度30%~50%。

8）細胞生長狀態(tài)不佳,。清除支原體,、真菌、細菌等污染,，保證提供新鮮的生長培養(yǎng)基,。

9）轉(zhuǎn)染時細胞上清液中含有抗生素、生長因子等,，大大降低轉(zhuǎn)染效率,。

2.3轉(zhuǎn)染后

10) 轉(zhuǎn)染時間過短。一般質(zhì)粒表達水平在24~48h,，mRNA表達水平在24~72 h,，蛋白表達水平在48~96 h。

3.細胞毒性大

3.1轉(zhuǎn)染前

1）核酸純度不純也會造成細胞毒性,。要確保質(zhì)粒中無內(nèi)毒素,，使用高純度的DNA或RNA會降低細胞毒性。

2）轉(zhuǎn)染試劑過量,。優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑的用量,，以及優(yōu)化復合物的比例。

3）要檢查稀釋復合物的培養(yǎng)基與細胞的相容性,，已知DMEM培養(yǎng)基對一些昆蟲細胞系有毒性,。建議選擇合適的培養(yǎng)基。

3.2轉(zhuǎn)染時

4）細胞密度過低,，會導致部分細胞死亡,。DNA轉(zhuǎn)染細胞密度90%~95%，RNA轉(zhuǎn)染細胞密度30%-50%,。

5）細胞生長狀態(tài)不佳,。清除支原體、真菌,、細菌等污染,，保證提供新鮮的生長培養(yǎng)基。

3.3轉(zhuǎn)染后

6）轉(zhuǎn)染后目的蛋白的過度表達對細胞產(chǎn)生毒性,。建議及時更換新鮮培養(yǎng)基,，或者添加一些營養(yǎng)物質(zhì)。

7）轉(zhuǎn)染后表達蛋白對細胞產(chǎn)生毒性,。建議換一種細胞系重新轉(zhuǎn)染,。

8）轉(zhuǎn)染時間過短，就進行抗性篩選,。一般質(zhì)粒表達水平在24~48h,，mRNA表達水平在24~72 h，蛋白表達水平在48~96 h,。

9）抗性篩選時,，加入的抗生素濃度過高。適當降低抗生素的濃度,。

4.重復性差

4.1轉(zhuǎn)染前

1）移液誤差,。將DNA/RNA和轉(zhuǎn)染試劑充分打勻后,，用移液器緩慢均勻的吸取，避免產(chǎn)生誤差,。

2）制備復合物時,，未充分混勻。將DNA/RNA和轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻,，并保證相同的孵育時間,。

4.2轉(zhuǎn)染時

3）細胞密度存在差異。一般在特定的密度范圍內(nèi),，細胞密度越低,，轉(zhuǎn)染效率越低，相反越高,。

4）細胞生長狀態(tài)存在差異,。好的細胞狀態(tài)，轉(zhuǎn)染效率越高,。

5）細胞傳代次數(shù)不同,。對于多次傳代的細胞，細胞的基因組和表型都會發(fā)生變化,，不建議使用傳代次數(shù)過多的細胞進行轉(zhuǎn)染實驗,。

4.3轉(zhuǎn)染后

6）轉(zhuǎn)染時間不一致，表達的蛋白水平會有差異,。

5.相關(guān)文獻及產(chǎn)品

已發(fā)表文章

[1] Chen T, Chen Y, Chen H, et al. Dual-enzyme-propelled unbounded DNA walking nanomachine for intracellular imaging of lowly expressed microRNA[J]. Nano Research, 2019, 12(5): 1055-1060. （IF 8.21）

[2] Zhang X, Qi Z, Yin H, et al. Interaction between p53 and Ras signaling controls cisplatin resistance via HDAC4-and HIF-1α-mediated regulation of apoptosis and autophagy[J]. Theranostics, 2019, 9(4): 1096.  (IF 8.12)

[3] Zhang K, Zhao X, et al. Enhanced Therapeutic Effects of Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes with an Injectable Hydrogel for Hindlimb Ischemia Treatment. ACS Appl Mater Interfaces. 2018 Sep 12;10(36):30081-30091.（IF 8.09）

[4] Chen Y, Hao Q, Wang J, et al. Ubiquitin ligase TRIM71 suppresses ovarian tumorigenesis by degrading mutant p53[J]. Cell Death and Disease, 2019, 10(10): 1-14. (IF 5.72)

相關(guān)產(chǎn)品