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外泌體研究歷程，你知多少,？
外泌體（Exosome）參與細(xì)胞之間的交流,，物質(zhì)的運(yùn)輸以及正常生理過程的維持,、還與疾病息息相關(guān)，越來越多的人做這方面的研究,。關(guān)于外泌體提取,、組成,、“載體”和相應(yīng)功能的精///準(zhǔn)分子機(jī)制近些年越來越受到關(guān)注，而且發(fā)表的有關(guān)外泌體的文章也在逐年增加,。外泌體（Exosome）的研究歷程主要包括外泌體提取與純化、外泌體鑒定與檢測(cè),、外泌體熒光標(biāo)記、和外泌體的蛋白組學(xué)以及下游機(jī)制研究等,。下面我們就簡(jiǎn)單介紹一下外泌體的研究歷程。
1.什么是外泌體,？
外泌體（Exosome）是一種由活細(xì)胞分泌到細(xì)胞外環(huán)境的膜性小囊泡,，是細(xì)胞間信息傳遞的重要載體,。外泌體天然存在于體液中，參與細(xì)胞間相互作用,。
2.外泌體組成與功能
外泌體（Exosome）攜帶大量特異性的蛋白質(zhì)以及功能性的mRNAs,、miRNAs等,，在體內(nèi)參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移,、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過程，與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)程密切相關(guān),。不僅可以作為診斷多種疾病的生物指標(biāo)，也可以作為治療手段,，未來有可能作為藥物的天然載體用于臨床治療，是液態(tài)活檢領(lǐng)域“三駕馬車”之一,。目前外泌體研究主要集中在外泌體提取,、純化,、鑒定和分析上。
圖1 外泌體組分
3.外泌體分離方法
目前已經(jīng)開發(fā)出多種外泌體（Exosome）提取方法包括：密度梯度,，體積排阻，免疫磁珠和基于聚合物沉淀的方法,。根據(jù)外泌體的體積,，密度和表面標(biāo)志物的不同進(jìn)行分離，不同提取外泌體方法優(yōu)劣勢(shì)比較如下：
分離方法 | 分離原理 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
超速離心法 | 根據(jù)顆粒的密度,，大小，形態(tài)逐級(jí)離心 | 成本低,；容量大,； 試劑污染小,。 | 儀器價(jià)格比較高； 操作時(shí)間比較長(zhǎng),； 外泌體形態(tài)受損,。 |
超濾法 | 超濾膜用于從蛋白質(zhì)和其它大分子分離外泌體,。外泌體群集中在膜上。 | 速度快； 不需要特殊儀器,； 使用輕便,。 | 壓力會(huì)破壞外泌體,； 吸附造成損失；堵塞濾膜,。 |
體積排阻法 | 體積排阻層析分離基于它們的大小,。它使用填充有多孔聚合珠的柱子。 | 純度高,；外泌體形態(tài)和活性較好； 重復(fù)性強(qiáng),； 上樣量大 | 需要精密的儀器,； 花費(fèi)較大； 時(shí)間比較長(zhǎng),。 |
外泌體沉降法 | 利用外泌體的溶解度或者分散性通過排水聚合物進(jìn)行沉淀 | 使用方便；不需要特殊儀器,； 可以大量制備,。
| 非外泌體物質(zhì)會(huì)發(fā)生共沉淀。 例如蛋白質(zhì),，RNA，聚合物原料,，需要進(jìn)行樣品的前處理和后處理,。 |
免疫磁珠法 | 通過外泌體表面蛋白的抗原抗體相互作用 | 特異性強(qiáng)； 純度較高,。
| 試劑價(jià)格昂貴； 適用性比較低,； 產(chǎn)量較低,； 只針對(duì)沒有細(xì)胞的樣品。 |
色譜法 | 根據(jù)外泌體的大小進(jìn)行分離 | 得到的外泌體大小均一 | 設(shè)備特殊,，價(jià)格高，應(yīng)用不廣泛 |
目前翌圣生物公司提供的細(xì)胞上清/血清血漿外泌體提取試劑盒（貨號(hào):41201ES25和41202ES30）,，采用*的分離技術(shù),，可以快速?gòu)募?xì)胞培養(yǎng)上清中獲得大量完整的外泌體顆粒,，適用于下游的細(xì)胞共培養(yǎng),、電鏡分析、Western Blot,、熒光定量（qPCR）和高通量測(cè)序等應(yīng)用,。細(xì)胞上清外泌體抽提試劑實(shí)驗(yàn)流程如下：
圖2 細(xì)胞上清外泌體抽提試劑盒實(shí)驗(yàn)流程
4.外泌體鑒定
外泌體的功能研究第—步,，即進(jìn)行外泌體的鑒定。目前包括電鏡法,、NTA粒徑法,、WB法、核酸分析法等來鑒定外泌體的結(jié)構(gòu),、特異性蛋白,、核酸序列等。
結(jié)構(gòu)分析--電鏡法
在外泌體研究中,，電鏡能夠直接觀察到樣品中外泌體的形態(tài)。并且具有很高的分辨率,，能夠鑒別大小不一的外泌體,。但對(duì)樣品的預(yù)處理和制備上面要求較高，樣品的準(zhǔn)備階段比較復(fù)雜,，不適合對(duì)外泌體進(jìn)行大量快速的測(cè)量。而且由于外泌體經(jīng)過了預(yù)處理和制備過程,，無法準(zhǔn)確的進(jìn)行外泌體濃度的測(cè)量,。
圖2 電鏡分析外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖片來源：Current protocols in cellbiology(2006): 3-22）
結(jié)構(gòu)分析--NTA技術(shù)
NTA技術(shù)是表征外泌體的濃度粒徑測(cè)試手段之一,，對(duì)不同大小的外泌體顆粒追蹤和分析，可計(jì)算出外泌體的直徑和濃度,。相較于其他表征方式,，NTA技術(shù)的樣本處理更簡(jiǎn)單,、更能保證外泌體原始狀態(tài),、檢測(cè)速度更快。
圖3 NTA分析外泌體顆粒直徑符合標(biāo)準(zhǔn),， 顆粒分散性好，大小均一,。
蛋白鑒定-WB分析
WB分析典型的標(biāo)記蛋白包括四跨膜蛋白超家族,，如CD9、CD63,、CD81等，定性鑒定檢測(cè)需要選擇至少2個(gè)指標(biāo)才能達(dá)到文章發(fā)表要求,，比如檢測(cè)CD63和TSG101,。外泌體鑒定試劑盒（貨號(hào)：41203ES05）是翊圣生物針對(duì)外泌體標(biāo)志蛋白CD63和TSG101檢測(cè)而研發(fā)的一款高效且方便的外泌體鑒定試劑盒產(chǎn)品,。該抗體經(jīng)過嚴(yán)格篩選而得，適用于外泌體CD63和TSG101蛋白的檢測(cè),。
該產(chǎn)品適用于人,、大鼠,、小鼠外泌體的鑒定。
圖4 P為CD63&TSG101陽性對(duì)照品,；S為外泌體樣品
核酸鑒定-qPCR法/NGS測(cè)序
外泌體中含有大量的RNA和DNA,，包括功能性的 mRNAs,、miRNAs、lncRNA,、mtDNA等,，這些RNA分子以外泌體為載體進(jìn)入靶細(xì)胞后,，會(huì)通過不同的機(jī)制對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生影響。可通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法,、高通量測(cè)序技術(shù)分析外泌體RNA分子差異,，是對(duì)外泌體RNA功能研究的有效手段。
圖5 qPCR法分析細(xì)胞上清液提取出的外泌體
5.外泌體熒光標(biāo)記
通過對(duì)外泌體體外熒光標(biāo)記示蹤,，可以對(duì)外泌體功能性進(jìn)行研究,，包括蛋白組學(xué)研究、外泌體活體成像實(shí)驗(yàn),、外泌體啟動(dòng)子活性研究等。目前熒光標(biāo)記外泌體的方法有很多,，主要包括親脂性染料PKH-67/PKH-26,、親脂性羰花青染料DiI/DiD/DiO/DiR,、以及滲透型的化合物標(biāo)記法：CFSE/CFDA/Calcein-AM等。
6.外泌體相關(guān)FAQ
1.不同樣本提取外泌體參考體積,？
| 樣本體積（參考量） | |
樣本類型 | 電鏡,、NTA粒徑,、Western Blot | 多基因核酸分析（qPCR）、NGS測(cè)序 |
細(xì)胞上清* | 10-20 mL | 40-60 mL |
血清 | 1 mL | 2 mL |
血漿 | 1 mL | 2 mL |
尿液 | 20 mL | 50-60 mL |
腦脊液 | 10 mL | 20-30mL |
精液 | 1-2 mL | 2-5 mL |
唾液 | 5-10 mL | 10-20 mL |
腹水 | 10-20 mL | 20-40 mL |
羊水 | 10-20 mL | 20-40 mL |
乳液 | 5 mL | 10-20 mL |
2.外泌體血液樣本提取需注意事項(xiàng),？
全血經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間放置，冷凍,、離心,、會(huì)發(fā)生溶血現(xiàn)象,，無法提取外泌體，必須做好血清血漿的分離,。以及去除血清外源的外泌體。
3.如何去除血清外源的外泌體,。
a.將細(xì)胞培養(yǎng)用的血清通過1×105g超速離心10h,，去除血清外泌體；b. 選擇無血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),。
4.細(xì)胞上清外泌體提取試劑盒（貨號(hào)：41202）可以提取哪些樣本的外泌體？
細(xì)胞上清液,、尿液（可直接提?。?、腦脊液（需處理后再提?。Ｆ渌慕M織液包括體液,、唾液、卵泡液,、精液等提取效率較低,，建議客戶用專門的組織液提取試劑盒,。
5.如何提取組織細(xì)胞外泌體？
無菌環(huán)境下將組織剪成小塊（越小越好）,，然后在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h,；將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中,，于4℃以3000g離心20 min去除培養(yǎng)液中雜質(zhì)和細(xì)胞碎片，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中,；先使用0.45μm濾器過濾上清液,，接著使用0.2μm濾器過濾上清液，再按照本試劑盒說明書提取外泌體,。
6.外泌體如何保存？
純化后的外泌體可于4℃保存不超過一周,，-80℃條件下可長(zhǎng)期保存,，避免反復(fù)凍融。
6.外泌體相關(guān)產(chǎn)品推薦
| 名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（元） |
外泌體提取 | HieffTM Quick exosome isolation kit for Cell Culture Media）細(xì)胞培養(yǎng)上清外泌體快速抽提試劑盒HOT | 41201ES25/50 | 25 mL/50 mL | 2155.00/ 3855.00 |
HieffTM Quick exosome isolation kit（ for Serum/Plasma） 血清/血漿外泌體快速抽提試劑盒HOT | 41202ES30 | 30 mL | 2155.00 | |
外泌體定量 | RIPA Lysis Buffer (Strong) RIPA裂解液（強(qiáng)）HOT | 20101ES60 | 100 mL | 228.00 |
BCA Protein Quantification Kit BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）HOT | 20201ES76 | 500T(100 mL) | 228.00
| |
外泌體鑒定（Western Blot） | Precast Protein Improve Gels, 4%-20%, 10 wells 4%-20%高分辨率梯度預(yù)制膠,10孔HOT | 36231ES10 | 1盒（10塊） | 573.00 |
GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker（10-180 kDa）三色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)HOT | 20351ES76 | 2×250 μL | 585.00 | |
外泌體標(biāo)記 | DiO (DiOC18(3)) 細(xì)胞膜綠色熒光探針 | 40725ES10/25 | 10/25 mg | 488.00/988.00 |
DiR Iodide (DiIC18(7)) 細(xì)胞膜深紅色熒光探針 | 40757ES25 | 25 mg | 988.00 |
