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【干貨】小磁珠,，大用途,，分選純化，一個不落
引文：
基因測序越來越得到臨床的認可,，尤其是精準醫(yī)療概念提出以后,，更是備受青睞，為精準治療解答很多未知的問題,。高通量測序技術的跨越式發(fā)展,，使測序能力大幅上升，整個NGS工作流程中,，測序文庫的純化與篩選亦尤為重要,。今天，我們就聊一聊核酸純化分選小能手——磁珠,。
一,、背景介紹
磁珠的發(fā)明構想初來自于挪威科技大學的化學家John Ugelstad ，1976年他以聚苯乙烯為主要材料，制造出均勻磁化的球體粒子,。1979年Vogelstein等報道在高濃度dian化鈉存在下玻璃粉末作為吸附劑用于從瓊脂糖凝膠中提取DNA///片段,，而后基于硅膠和其他具有親水性表面的載體的固相核酸純化技術廣泛發(fā)展起來。
二,、原理解讀
在整個體系中,，影響DNA回收的因素包括聚乙二醇（PEG）、DNA大小和濃度,、孵育時間等,，其中PEG是影響DNA回收的決定性因素。DNA在較高濃度的PEG和NaCl中脫去分子水化層,，分子構象由線狀被壓縮成卷曲球狀,，并暴露出大量帶負電荷的磷酸基團，帶負電荷的磷酸基團與羧基在Na+的作用下形成“電橋",，使DNA被特異吸附到磁珠表面,。當PEG和NaCl被去除之后，加入水性分子,，會快速充分水化DNA,，解除三者間的離子作用，使得吸附到磁珠的DNA被純化出來,。 此外,，不同長度的DNA隨PEG分子量、濃度以及鹽濃度的不同,，可以被選擇性的沉淀出來,。
圖 磁珠純化原理示意圖
三、應用
磁珠憑借其高通量,，適用于自動化的特點在高通量測序中備受推崇,，并廣泛用于NGS建庫中的產(chǎn)物純化/分選。
1. DNA純化
DNA純化的目的在于去除不想要的DNA///片段,。由于磁珠優(yōu)先吸附大片段,，因而可通過一定比例的磁珠吸附特定大小以上的片段，丟棄上清中的非目標片段,，之后將磁珠吸附的目的DNA洗脫回收,。常用于小片段如接頭二聚體/引物二聚體的去除。此外還有一些客戶會用于樣本的富集,。
圖DNA純化操作示意圖
DNA樣本經(jīng)磁珠純化后會有部分樣本的損失,，磁珠回收效率可評估磁珠的回收能力。通?？赏ㄟ^計算得出：回收效率=（純化后的DNA質量/Input DNA質量）×100%,，如下表：
表 磁珠回收效率計算
測試人 | 樣本編號 | 投入量（ng） | 純化后總量（ng） | 回收率（%） | 平均回收效率（%） |
測試人1 （1.8×） | A | 169.5 | 153.25 | 90.41 | 90.41 |
B | 159.75 | 94.25 | 94.5 | ||
C | 162 | 95.58 | |||
D | 158.75 | 93.66 | |||
測試人2 （1.8×） | A | 169.5 | 154.5 | 91.15 | 91.15 |
B | 155 | 91.45 | 91.94 | ||
C | 154.25 | 91 | |||
D | 158.25 | 93.36 |
【注】：磁珠測試數(shù)據(jù)來源于上海某生物公司, 表格中A是B*磁珠,，B、C,、D分別是翊圣三個不同批次的磁珠,。
2. DNA雙輪分選（片篩）
由于二代測序段短讀長的局限性，所以終的NGS文庫需滿足一定的長度要求,。片篩的目的在于從片段化DNA中選擇特定區(qū)域的DNA///片段,，以滿足上機需求。比如將樣本中的片段分布比作下圖中的正態(tài)分布,，由于磁珠優(yōu)先吸附大片段,，所以第—輪磁珠吸附目的片段以上的大片段，此時棄磁珠留上清（目的片段在上清中）,。第二輪磁珠吸附目的片段，此時棄上清,，再將磁珠上的目的片段洗脫回收,。
圖DNA雙輪分選操作示意圖
分選精度則是評估不同的磁珠投入比例分選得到的片段大小。一般以Agilent 2100儀器檢測,。
在特定磁珠比例（0.45×/0.15×）條件下,，不同樣本分選后片段分布范圍集中在同一位置。較好的分選效果應該是頂部窄而圓潤的獨峰,。此外不同廠家由于buffer的不同在特定磁珠比例條件下分布也會有一定的差異,，使用前需根據(jù)各廠家相應的說明書確認目標片段的分選比例。
圖 不同樣本磁珠分選精度示意圖
四,、明星產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品名稱：Hieff NGS® DNA Selection Beads（點這里）
產(chǎn)品特點：
*：采用進口原材料,，品質高度穩(wěn)定。
無縫替換：產(chǎn)品原理,、產(chǎn)品操作和實驗結果與AMPure XP保持高度一致,。
兼容性高：兼容目前市面上所有的DNA/RNA建庫試劑盒。
批次穩(wěn)定：嚴格的批次性能與穩(wěn)定性質控,，單次產(chǎn)能20L,。
性能展示1：分選效果與XP高度一致：如下圖所示，相同的分選比例,，翊圣磁珠與XP磁珠,，分選效果相當。
圖 磁珠分選精度與XP對比示意圖
性能展示2：回收效果與XP高度一致：如下表所示,，分別用0.8x和0.6x的回收比例對DNA marker和打斷的gDNA進行回收,，翊圣3個批次的磁珠和XP磁珠回收效果相當。
【注】：磁珠測試數(shù)據(jù)來源于杭州某生物公司, 表格中分別是B*磁珠與翊圣三個不同批次的磁珠,。
磁珠介紹到這里就結束了,，希望以上總結可以幫助到正在努力實驗的你,。
