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NGS在腫瘤檢測中的那些事兒
一,、背景介紹
20世紀(jì)以來，癌癥已成為困擾人類健康的主要危害之一,。根據(jù)2019年國家癌癥中心發(fā)布的2015年全國//////新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù),，2015年惡性腫瘤發(fā)病約392.9萬人，死亡約233.8萬人,。平均每天超1萬人被確診為癌癥,，每分鐘7.5個人確診癌癥。癌癥負(fù)擔(dān)呈持續(xù)上升態(tài)勢,，近10多年來,，惡性腫瘤發(fā)病率每年保持約3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅,。因而腫瘤基因突變檢測對指導(dǎo)腫瘤靶向治療,、耐藥監(jiān)測及預(yù)后判斷有重要意義。
圖1：中國2015年惡性腫瘤發(fā)病與死亡人數(shù)圖
二,、腫瘤突變類型
腫瘤突變主要來源于體細(xì)胞突變和胚系突變,。
胚系突變(germline mutation)又稱生殖細(xì)胞突變，是來源于精子或者卵子這些生殖細(xì)胞的突變,，因此身上所有的細(xì)胞都帶有突變,，目前主要是BRCA1/2，一般研究較少,。
體細(xì)胞突變(somatic mutation)又稱獲得性突變,，是指在生長發(fā)育過程中或者環(huán)境因素影響下后天獲得的突變，通常身上只有部分細(xì)胞帶有突變,。
圖2：基因突變類型解析圖
體細(xì)胞突變包括序列變異,、結(jié)構(gòu)變異,、腫瘤突變負(fù)荷（TMB）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）,。其中序列變異包括SNV(Single Nucleotide Variation)和Indel（Insertion & deletion）,。結(jié)構(gòu)變異包含Deletion、Duplication,、Inversion和Translocation,。
圖3：序列變異和結(jié)構(gòu)變異解析圖
名詞解釋：
TMB就是基因中發(fā)生錯誤的密碼總量。TMB越高,，那么可能相應(yīng)的腫瘤相關(guān)的致癌突變越多,，每個腫瘤的個性就越突出，越不同于正常細(xì)胞,。腫瘤免疫治療的原理就是通過加強機體免疫系統(tǒng)對腫瘤的識別和殺傷,。而腫瘤突變負(fù)荷越大（TMB越高），突變越多的癌細(xì)胞,，越不像正常細(xì)胞,，越容易被免疫細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，自然無法逃脫免疫系統(tǒng)的追殺,。一般認(rèn)為TMB超過20個突變/Mb（Mb代表的就是每百萬個堿基）就是高,，低于10個突變/Mb就是低。當(dāng)然,，不同的公司,，由于所采用的基因套餐以及技術(shù)不同，略有差異,。
MSI指的是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性,，指的是在DNA復(fù)制過程中段片段插入或者缺失突變引起的微衛(wèi)星序列長度改變的現(xiàn)象，通常由錯配修復(fù)MMR功能缺陷引起,。以二核苷酸重復(fù)序列（CA/GT）n///為常見,，n一般是15-60次。MSI在維持基因組穩(wěn)定以及調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用,，且個體差異較大,。
三、常見的腫瘤突變檢測技術(shù)
傳統(tǒng)的腫瘤檢測方法包括Sanger測序,、焦磷酸測序和實時熒光PCR等,，僅能對單個基因或者單個基因的外顯子突變進(jìn)行檢測，對復(fù)雜變異類型的檢測存在局限性,。高通量測序（Nextgeneration sequencing,NGS）能夠同時對上百萬甚至數(shù)十億個DNA///片段進(jìn)行測序,，因此可以在較低的成本下對多至上百個腫瘤相關(guān)基因、全外顯子及全基因組進(jìn)行檢測,。
方法 | 優(yōu)點 | 局限 |
Sanger測序 | 讀長較長,，準(zhǔn)確性高 | 通量小,、成本高、需要樣品量大 |
焦磷酸測序 | 讀長較長,，平均可達(dá)400bp,。 | 成本高，在測序過程中引入插入和缺失的測序錯誤 |
實時熒光PCR | 靈敏度與特異性高,，準(zhǔn)確性較好,，實現(xiàn)快速鑒定。適合于大量樣本,、少量位點 | 價格貴,，不能讀出序列，不太直觀 |
NGS | 不依賴于已知的核酸序列,，不需額外設(shè)計探針,，需要樣品量少，靈敏度高 | 讀長短（200-500bp）,，可重復(fù)性低,，拼接組裝的難點 |
四、應(yīng)用NGS進(jìn)行腫瘤檢測的技術(shù)路線
NGS進(jìn)行腫瘤基因突變檢測的技術(shù)路線主要包括：全基因組測序（WGS）,、全外顯子測序（WES）和靶向捕獲測序（targeted sequencing）,。
圖4：腫瘤檢測技術(shù)路線圖
全基因組測序：
全基因組測序可對整個基因組區(qū)域進(jìn)行測序，包括編碼區(qū),、非編碼區(qū)等所有的基因區(qū)域進(jìn)行測序,。可實現(xiàn)對人類基因組范圍內(nèi)所有的變異類型進(jìn)行分析,，包括SNV,、 Indel,、CNV和 SV,，甚至可以進(jìn)行染色體水平變異的分析,。弊端是測序需要很大的數(shù)據(jù)量，成本高,，而且其中以大部分?jǐn)?shù)據(jù)目前尚不能解釋,，因此離實際臨床應(yīng)用還存在較大距離。
全外顯子測序：
全外顯子測序可對基因組上所有的基因外顯子區(qū)域進(jìn)行測序,。全外顯子覆蓋人類基因組1-2%的蛋白質(zhì)編碼序列,。相比于WGS減少了對非編碼區(qū)的測序，成本更低,，并且可以獲得更高的測序深度和檢測分辨率,。但WES對于臨床檢測來說，腫瘤基因檢測測序深度較高，所需的數(shù)據(jù)量相對較高,，因此從臨床應(yīng)用以及成本考慮,，WES并未被廣泛接受。
靶向捕獲測序：
靶向測序是指選擇基因組上感興趣的基因或基因區(qū)域作為靶向檢測區(qū)域,，可以是幾個基因上的個別外顯子區(qū)域,，也可以是幾百上千個基因上的全部外顯子區(qū)域。靶向測序兼顧了實際檢測需求,，又降低了測序成本,，因此目前在臨床上的應(yīng)用///為廣泛。常見方法主要有：探針雜交捕獲以及多重PCR擴增,。
五、小結(jié)
腫瘤問題屬于世界性難題,，一直威脅著人類的健康,，是人類生命健康的死敵。近幾年隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的快速發(fā)展,，生命醫(yī)療與生物科學(xué)的準(zhǔn)確對接,，NGS已經(jīng)逐步滲透到腫瘤病理分子診斷領(lǐng)域，大大豐富了腫瘤基因診斷的內(nèi)容,。NGS是目前常用的有效獲取人類癌癥基因組信息的高通量測序方法,，能夠勾畫出腫瘤相關(guān)的遺傳變異全景，NGS技術(shù)為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的進(jìn)一步發(fā)展提供了基礎(chǔ),。
六,、高效建庫，成就腫瘤突變精準(zhǔn)
產(chǎn)品名稱：Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina® （點這里）
產(chǎn)品特點：
1）建庫流程更簡便：片段化/末修/加A一步完成,，大大縮減建庫時間,；
2）酶切可控時間長：酶切效果僅與時間有關(guān)，與物種來源以及樣本GC含量無關(guān),；
3）接頭連接更高效：接頭雙端連接效率高于60%,，業(yè)內(nèi)領(lǐng)///先；
4）文庫擴增更均一：高深度測序條件下,，均一性與KAPA HiFi Ready-mix高度一致,；
5）突變檢出更高效：突變檢出頻率與標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)期突變更接近。
性能展示：結(jié)果表明翊圣建庫試劑盒突變檢出更高效,。
【注】：實驗樣本：Horizon@HD701: Quantitative Multiplex Reference Standard gDNA
七,、產(chǎn)品信息
產(chǎn)品定位 | 名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
全能型建庫 | Hieff NGS® MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina® | 12200ES8/24/96 | 8/24/96 T |
Hieff NGS® Ultima DNA Library Prep Kit for MGI® | 13310ES16/96/98 | 16/96/192 T | |
酶切法建庫 | Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina® | 12203ES8/24/96 | 8/24/96 T |
Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI | 13321ES16/96 | 16/96 T | |
環(huán)化試劑盒 | Hieff NGS® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI® | 13341ES16/96 | 16/96 T |
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測序數(shù)據(jù)不好,？是不是建庫出了問題,？！
