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干貨分享|磁珠常見問題與解決方案
高通量測序技術(shù)的跨越式發(fā)展,，使測序能力大幅上升,。在整個NGS工作流程中,，磁珠是*的產(chǎn)品,。
磁珠通過磁顆?；钚曰鶊F(tuán)在一定條件下可與核酸結(jié)合和解離的原理,，將樣本中目的片段分離,。可實(shí)現(xiàn)對核酸樣本的高通量自動化操作,，廣泛應(yīng)用于基因測序以及分子診斷領(lǐng)域,。
看起來很簡單的純化/分選實(shí)驗(yàn)，卻在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中有各種意外的情況,。那關(guān)于磁珠產(chǎn)品選擇和產(chǎn)品使用方面有什么需要注意的事項(xiàng)呢,？接下來小翊將從磁珠的外觀、儲存,、應(yīng)用和使用效果逐一對癥分析,，希望能幫助大家了解磁珠實(shí)驗(yàn)中的那些事。
磁珠外觀
Q：如何從磁珠的外觀區(qū)分磁珠是否正常,？
A：正常磁珠靜置時(shí),，微珠與buffer分層，聚集在瓶身底部,，使用前震蕩混勻,，微珠均勻分布在buffer中。非正常磁珠由于 β-巰基乙醇,、DTT,、pH差值大等因素，影響磁珠的均一性,，使得磁珠粘稠,，聚集成塊或出現(xiàn)掛壁的現(xiàn)象。
圖1：正常磁珠外觀圖
圖2：非正常磁珠外觀圖
磁珠儲存
Q： 不小心將磁珠放到-20℃,，但未結(jié)冰,，是否可以繼續(xù)使用,？
A：不建議使用。因?yàn)榈蜏貢茐拇胖榈慕Y(jié)構(gòu),，使得磁珠的抓取效率降低,，影響磁珠回收性能。
Q：磁珠未開封的時(shí)候4℃保存,，開封后一直室溫保存使用,，是否會影響磁珠的回收性能？
A：室溫放置對磁珠的回收性能會有一定影響,，不建議室溫放置太久,，使用完后建議4℃保存。PEG分離效果易受pH,、溫度等影響,。
磁珠應(yīng)用
Q：磁珠分選的原理是什么？
A：第—輪磁珠結(jié)合分子量較大的DNA,，通過丟棄磁珠去除這部分產(chǎn)物,；第二輪磁珠結(jié)合剩余產(chǎn)物中分子量較大的DNA，通過丟棄上清去除分子量較小的DNA,。
初始樣品中的很多組分都會干擾雙輪磁珠分選效果,。因此，當(dāng)分選方案執(zhí)行位置不同時(shí),，雙輪磁珠使用量也不盡相同,。
Q：產(chǎn)品的主要應(yīng)用是什么？
A：產(chǎn)品主要應(yīng)用于高通量測序DNA///片段的純化和分選,。對于PCR或者酶切DNA產(chǎn)物的純化也可以使用,。可以有效去除dNTP,，引物,，引物二聚體，接頭,，接頭二聚體,，鹽離子等雜質(zhì)。
Q：產(chǎn)品可以重復(fù)使用嗎,？
A：產(chǎn)品不可以重復(fù)使用,，乙醇洗脫步驟將影響磁珠表面活性基團(tuán)性能。
Q：與AMPure XP相比,，怎么樣,？
A：我們的產(chǎn)品制備原材料*進(jìn)口，可以完美替代AMPure XP Beads,。在使用方法,，文庫大小分布和回收效率上,，與AMPure XP Beads*一致，您可以直接按照AMPure XP Beads的操作方式使用,，無需摸索條件,。
Q： 磁珠可以吸附ssDNA嗎？
A：可以回收單鏈DNA,，具體性能沒有測試過,。附圖是Beckman磁珠回收單鏈DNA的數(shù)據(jù)，可以作為參考,。
圖3：XP磁珠回收單鏈DNA效果圖
Q： 分選磁珠可以純化gDNA嗎？
A：翊圣分選磁珠測試過大20kb的片段,，回收率>90%,。基因組 DNA 未測試過,，測試時(shí),，由于大DNA與磁珠結(jié)合的非常緊，建議盡量增加洗脫液體積,，避免干燥時(shí)間過久,。
Q: 分選磁珠是否可以進(jìn)行片段產(chǎn)物純化？
A: 根據(jù)客戶反饋結(jié)果,，分選磁珠可以進(jìn)行片段產(chǎn)物的純化,。0.8×磁珠可以吸附 200 bp 以上的產(chǎn)物，通過去除上清即可對 200 bp 以下的片段進(jìn)行去除,；1.4×磁珠可以吸附 150 bp 以上的產(chǎn)物,，通過去除上清即可對 150 bp 以下的片段進(jìn)行去除。
Q：磁珠的DNA結(jié)合能力怎么樣,？
A：在目前的磁珠體系中,，磁珠的吸附能力均為過飽和，客戶不必?fù)?dān)心磁珠結(jié)合能力不足的情況,。根據(jù)已知的報(bào)道,，每1 μL磁珠可以結(jié)合7 μg DNA。
Q： 使用磁珠吸附小片段的時(shí)候,，大片段也會吸附上來嗎,？
A: 磁珠優(yōu)先吸附大片段，增大磁珠投入量時(shí),，磁珠會在吸附大片段的基礎(chǔ)上增強(qiáng)吸附小片段的能力,。
舉例說明：參考磁珠純化分選表，100 μL樣本,，加入80 μL磁珠Cat#12601,此時(shí)磁珠上吸附的是>350 bp的片段,，但是,，當(dāng)磁珠投入量至100 μL時(shí)，磁珠上吸附的是>200 bp的片段,。
Q：分選磁珠是否可以用于提取DNA,？
A：使用分選磁珠可以實(shí)現(xiàn)直接將樣本裂解后用磁珠將其中的gDNA提取出來，可能效率沒有試劑盒的高,，因?yàn)槲覀冞@款磁珠的定位是在純化和分選,。
磁珠使用效果
Q：使用磁珠分選/純化之后，還有小片段殘留是怎么回事,？
圖4：二聚體殘留效果圖
A：小片段殘留大部分是接頭二聚體（127bp）/引物二聚體（80bp）,。若純化，降低磁珠比例,；若分選：可適當(dāng)降低二輪磁珠比例可有效改善此類情況,。
Q：磁珠回收率低可能的原因是什么？
A：1）磁珠與DNA混勻不充分,，未能充分吸附,。建議反應(yīng)體系充分混勻；
2）磁珠比例不對,，建議按照說明書進(jìn)行選擇合適的比例,；
3）孵育時(shí)間不足，保證孵育時(shí)間至少5 min,；
4）磁珠分選時(shí),，二輪磁珠吸附的時(shí)候吸到磁珠?？稍?00 μL 槍頭前串聯(lián) 10μL槍頭用于移液,，可防止吸到磁珠；
5）磁珠洗滌時(shí)的乙醇非現(xiàn)配,，導(dǎo)致乙醇濃度過低,，建議乙醇濃度不低于70%；
6）干燥過度：磁珠長時(shí)間干燥導(dǎo)致表面龜裂,，DNA難以洗脫,，得率降低；建議干燥時(shí)間不宜過長,，表面剛出現(xiàn)龜裂即可,；
7）洗脫液體積不足：終洗脫液應(yīng)*覆蓋管內(nèi)磁珠。
Q：純化后DNA在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)不理想,。
A：由乙醇?xì)埩粢?，可能是操作時(shí)磁珠分離時(shí)間過短或磁力器磁力較弱，洗脫步驟中吸取上清速度過快等,。建議確保在后一步洗滌結(jié)束后,，溶液中無殘留乙醇,。磁珠可于室溫干燥5-10分鐘，使乙醇*干燥,。
Q: 使用 12601 分選磁珠,，分選出的文庫大小不對稱是怎么回事？
圖5：分選文庫大小不對稱效果圖
A：操作問題,，磁珠比例應(yīng)嚴(yán)格按照說明書,，另外移液時(shí)為避免吸到磁珠，底部需殘留 1-2μL 液體,。
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