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Qubit核酸濃度檢測,，小翊送你資料匯總
（包含實(shí)驗常見問題解析）
背景簡介：
目前,，實(shí)驗室大多采用分光光度計來對DNA和RNA進(jìn)行定量,。雖然這種方法被廣泛采用,，但并不意味著它的讀數(shù)是準(zhǔn)確而可靠的。因為紫外吸光度測量不具有選擇性,，無法區(qū)分DNA,、RNA或蛋白質(zhì),，同時一些游離核苷酸或多余的鹽離子也會影響檢測的數(shù)值。此外,，紫外分光光度計的靈敏度不足,，無法完成低濃度DNA和RNA的定量。
基于此,，Life Technologies（賽默飛世爾旗下）推出了Qubit,，我們一起來探索一下qubit的神奇之處。
Qubit熒光計
Qubit熒光計是新一代核酸和蛋白定量儀,，是Thermo研發(fā)生產(chǎn)的一種檢測核酸質(zhì)量和數(shù)量,，并對RNA、ssDNA,、dsDNA,、蛋白質(zhì)等進(jìn)行定量的小型儀器，主要用于需要進(jìn)行高靈敏性,、高特異性及高度測量的實(shí)驗應(yīng)用,。 目前主要是以qubit3.0和qubit4.0為主。
儀器原理
采用熒光染料檢測特定目標(biāo)分子的濃度,，配套只有與DNA,、RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光的特異性熒光染料。這些熒光染料只有與特異性的靶分子結(jié)合時才能發(fā)出熒光信號,，采用專門的熒光檢測技術(shù)，檢測特定目標(biāo)分子的濃度,，從而對DNA和RNA進(jìn)行定量,。
實(shí)驗操作
簡單兩步
1. 配置標(biāo)準(zhǔn)品并測量，儀器自動校正并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,；
2. 配置檢測樣本,，上機(jī)檢測
圖2. Qubit實(shí)驗操作流程圖
特點(diǎn)
Qubit技術(shù)只檢測靶分子（而不是污染物）的濃度，比如：Qubit檢測雙鏈DNA濃度時,，特異性檢測待測樣本中的的雙鏈DNA,，對于樣本中存在的單鏈DNA或者RNA不檢測。
這種特異性可以獲得十分的結(jié)果,，對于芯片分析（Microarray）和實(shí)時定量PCR（qPCR）而言,，測定樣本中的DNA或RNA是必需的。同時在新一代測序（NGS）實(shí)驗中,，對我們后續(xù)的建庫過程也是很必要的,。
常見問題匯總
1.Qubit檢測能否指示核酸樣品中的樣品質(zhì)量？
不能,，Qubit 檢測僅 樣品中DNA/RNA的量,。 Qubit熒光計不能獲取吸光度讀數(shù)以提供A260 / A280比率或檢測核酸樣品中的蛋白質(zhì),。質(zhì)量情況可以使用NanoDrop儀器完成。
2. 產(chǎn)品成分只有兩個標(biāo)準(zhǔn)品,，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的時候需要對standard 2進(jìn)行稀釋嗎,？
使用產(chǎn)品時可直接用兩個標(biāo)準(zhǔn)品測定熒光值后做標(biāo)準(zhǔn)曲線，即兩點(diǎn)連成直線,。
如果想稀釋多個梯度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,，也可以使用1×TE對standard 2 進(jìn)行梯度稀釋。
另如果擔(dān)心96孔板測試時候熒光相互干擾,，可選擇黑色的底部透明板,。
3.使用酶標(biāo)儀做Qubit檢測，Ex值480 nm,，Em值520 nm,，但是我用的儀器沒有這兩個波長設(shè)置，其他的波長測定可以嗎,？準(zhǔn)確度和靈敏度與酶標(biāo)儀相比如何,？
可以，picogreen的吸收峰如下圖,，可知Ex在480nm處有大吸收峰,，Em在520nm處有大吸收峰，而如果儀器波長不在這兩個上面,，也是可以測定的,，只不過熒光值會低一點(diǎn)的。
Qubit定量分析的準(zhǔn)確度和靈敏度與酶標(biāo)儀的準(zhǔn)確度和靈敏度相同,。 這是產(chǎn)品開發(fā)過程中的一項要求,。
4. 為什么要做復(fù)孔？
Qubit是一個靈敏度比較高的濃度測定儀器,，測量值與樣本的質(zhì)量和外界的溫度都有關(guān)系,，增加復(fù)孔可以有效降低測量過程中帶來的誤差，保證數(shù)據(jù)的可準(zhǔn)確性,。
5. 復(fù)孔對應(yīng)的數(shù)據(jù)不一致,？
1）操作誤差；2）樣本質(zhì)量差,，濃度低對應(yīng)的誤差較大,；3）片段長度不均一（Qubit里面的染料對于不同長度的DNA結(jié)合能力有差別，重復(fù)對應(yīng)的時間不同,，熒光值不同）
6. 環(huán)境溫度不同,，測試的值會不同嗎？
會的,，Qubit里面對應(yīng)的熒光染料在不同的溫度下對應(yīng)的熒光信號強(qiáng)弱會有偏差的,，一般在低溫測出的值會偏大大,，高溫測出的值偏小（在試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品恢復(fù)室溫測試時,，整體誤差范圍在10%左右,，極限誤差在15%左右）
7.測試復(fù)孔的時候，連續(xù)測,，不取出來,，為什么值越來越小,？
連續(xù)在激發(fā)光激發(fā)的情況下,，熒光染料的半衰期會降低，此時對應(yīng)收集的熒光信號會降低,，對應(yīng)的數(shù)據(jù)會偏低,，建議讀取完數(shù)據(jù)之后，從儀器中取出,，5min左右再去測量,，基本不會有什么偏差
8. 如何檢測Qubit試劑的測試準(zhǔn)確性？
1）相對準(zhǔn)確,，參考life對應(yīng)試劑測量,，對比結(jié)果分析；
2）準(zhǔn)確,，試劑盒中配套的標(biāo)準(zhǔn)品,，經(jīng)過適當(dāng)稀釋之后，上機(jī)測試,，對比結(jié)果分析
對應(yīng)產(chǎn)品
dsDNA HS Assay Kit for Qubit®
——5min準(zhǔn)確定量結(jié)果
dsDNA Assay Kit for Qubit®是Yeasen生物開發(fā)的專門用于Qubit®熒光儀或熒光酶標(biāo)儀的試劑盒,，線性范圍0.2-100 ng，即使在存在ssDNA,、RNA和單體核苷酸的條件下，也可以選擇性的檢測dsDNA,，且耐受較高濃度的蛋白質(zhì),、鹽類、洗滌劑等污染物,。
簡便：無實(shí)驗操作簡單,，5min之內(nèi)出結(jié)果；
靈敏： 0.2-100ng的樣本,，都能準(zhǔn)確定量,；
準(zhǔn)確：競品同比誤差小，均控制在10%以內(nèi)批間差異??；
穩(wěn)定：不同生產(chǎn)批次之間無差異,。
訂購信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 價格（元） |
dsDNA HS Assay Kit for Qubit® | 12640ES60/76 | 100/500 T | 686/2696 |
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