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活死細菌,、細胞檢測
-----探尋生命的奧秘
背景介紹
真核生物（哺乳動物細胞）和原核生物（細菌）細胞增殖和細胞死亡間平衡對維持細胞有機的發(fā)育與生命的維持至關(guān)重要,，如果出現(xiàn)失衡將導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生,。活死狀態(tài)是研究生物增殖生長的常見研究目的,，例如,；對于真核活死細胞主要通過分析細胞質(zhì)膜完整性與細胞內(nèi)酯酶活性,，經(jīng)過特定儀器觀察判斷，為研究細胞狀態(tài)提供了一種方便的方法,，同時分析活細胞與死細胞,，用于評估細胞的活力。可以應(yīng)用于大多數(shù)的真核哺乳動物細胞,，但不適用于真菌和酵母,。主要對于藥物研究、毒性判定,、細胞生長狀態(tài)研究等,。
翊圣生物經(jīng)過匠心研發(fā)提供針對真核細胞和原核細胞的雙染檢測試劑盒，滿足您的研究所需,。
檢測原理
一,、 細胞染色
Calcein-AM是一種常用的對活細胞進行熒光標(biāo)記的細胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490 nm, Em=515 nm）,。 因其在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團,，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜,。一旦進入細胞后Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein,，從而被滯留在細胞內(nèi)并發(fā)出強綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA)相比,，由于Calcein, AM細胞毒性極低,，適合用于活細胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細胞功能,，如增殖和淋巴球的趨化性,。
由于死細胞缺乏酯酶，Calcein-AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標(biāo)記,。因此,，Calcein-AM常常與死細胞熒光探針如碘化丙啶（PI）等聯(lián)合使用，同時進行活細胞和死細胞的熒光雙重染色,。碘化丙啶（Propidium iodide,，PI）不能穿過活細胞的細胞膜，僅能穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核,，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光（Ex=535 nm, Em=617 nm）,，因此PI僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā),，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞,。而用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細胞。本試劑盒適用于熒光顯微鏡,、熒光酶標(biāo)儀,、流式細胞儀以及其他熒光檢測系統(tǒng)。
二,、細菌染色
熒光染料DMAO是一種綠色核酸熒光染料,，可將活細菌和死細菌染色。EthD-III是一種紅色核酸熒光染料,，僅能對細胞膜受損的死細菌染色,。將DMAO和EthD-III混合使用染色時具有完整細胞膜的細菌呈現(xiàn)綠色，而具有受損細胞膜的細菌呈現(xiàn)綠色和紅色,。結(jié)果可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀來分析,，適用于大多數(shù)細菌類型。
細菌活力的常見標(biāo)準(zhǔn)是細菌在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖的能力,，稱為生長測定,。該試劑盒通常與在液體或固體培養(yǎng)基中的生長測定結(jié)果有著很好的一致性。在某些條件下,，膜損傷的細菌可能會在營養(yǎng)培養(yǎng)基中恢復(fù)并繁殖,，而這種細菌在該測定中可能會被認為死亡。相反,，一些具有完整膜的細菌可能無法在營養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖,，但這些細菌在該測定中可能被認為是活的。因此,，如果發(fā)現(xiàn)該檢測和細菌生長測定之間有相當(dāng)大的差異,，應(yīng)該考慮上述的可能性。
應(yīng)用檢測
使用結(jié)果
1,、細胞染色結(jié)果
注：細胞類型=A375膠質(zhì)瘤細胞,，Calcein-AM=2 μM，PI=4.5 μM,，染色時間=15min
A為Calcein-AM染色圖,，B為PI染色圖，C為MERGE圖
2,、細菌染色結(jié)果
注：細胞類型=大腸桿菌,，EthD-III=2 ul，DMAO=4 ul,，染色時間=15min
A為EthD-III染色圖，B為DMAO染色圖,，C為MERGE圖
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