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溶酶體探針（LysoTracker & LysoSensor）
——酸性細(xì)胞器示蹤劑
背景介紹
溶酶體是一種分解蛋白質(zhì),、核酸、多糖等生物大分子的細(xì)胞器,。溶酶體具單層膜囊狀結(jié)構(gòu),，內(nèi)含60余種酸性水解酶,，包括蛋白酶、核酸酶,、糖苷酶,、脂酶等，分解各種外源和內(nèi)源的大分子物質(zhì),。溶酶體水解酶的適pH為3.5~5.5,，溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境是依靠膜上的特殊轉(zhuǎn)運蛋白(H泵)來維持的。溶酶體標(biāo)志酶為酸性磷酸酶,，目前針對溶酶體的定位也主要圍繞酸性磷酸酶展開,。
圖1.溶酶體結(jié)構(gòu)
溶酶體功能
溶酶體存在著形態(tài)上的多樣性和異質(zhì)性，根據(jù)溶酶體處于完成其生理功能的不同階段,， 大致分為以下幾種：
圖2.溶酶體分類及功能
溶酶體的主要功能是消化作用,，主要通過三種途徑消化底物：1.自體吞噬細(xì)胞內(nèi)原有的物質(zhì)；2吞噬體吞噬有害物質(zhì),；3.通過內(nèi)吞作用提供的營養(yǎng)物質(zhì),。吞噬作用也是細(xì)胞獲取營養(yǎng)的一種方式， 細(xì)胞通過內(nèi)吞作用將一些營養(yǎng)物質(zhì)包進內(nèi)吞體,，在溶酶體酶的作用下,，將吞進的營養(yǎng)物質(zhì)消化，用于合成代謝,。
圖3.溶酶體吞噬作用
溶酶體疾病及檢測手段
溶酶體的酶發(fā)生變異,，導(dǎo)致底物在溶酶體中大量堆積，影響細(xì)胞功能異常引起的疾病稱為溶酶體病,。溶酶體與許多疾病的發(fā)生有著極為密切的關(guān)系,，例如炎癥、矽肺,、尤其是先天性溶酶體缺陷等疾病都與溶酶體機能異常有關(guān),。溶酶體異常還與休克、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,、腫瘤等疾病發(fā)生有關(guān)聯(lián),。
目前檢測溶酶體異常的手段有很多,，包括光鏡鑒定法、電鏡鑒定法,、.細(xì)胞學(xué)檢測法等等,，這些方法可以直接檢測到溶酶體外形結(jié)構(gòu)、通透性,、pH變化等等,。目前人類也開發(fā)了一系列溶酶體檢測試劑盒，包括細(xì)胞膜通透性（LAP）完成性吖啶橙染色試劑,、LAMP抗體及二抗，還包括溶酶體探針類染料,，LysoTracker探針和LysoSensor探針,。LysoTracker探針和LysoSensor探針可以選擇性地標(biāo)記和追蹤活細(xì)胞酸性細(xì)胞器。
Yeasen生物提供多款不同熒光基團標(biāo)記的溶酶體探針如：綠色,、紅色,、黃色熒光基團等等，滿足您多標(biāo)實驗的不同需求,。
產(chǎn)品簡介
LysoTracker探針
LysoTracker探針,，由熒光基團連接到一個弱堿性基團組成，其中僅弱堿基團可部分提供質(zhì)子,，以維持pH在中性值,。這使LysoTracker探針可自由無阻地穿過細(xì)胞膜，特征性的聚集在球形細(xì)胞器,，對酸性細(xì)胞器有高選擇性,，用于活細(xì)胞溶酶體特異性熒光染色。機制尚不明確,，可能涉及細(xì)胞器膜上的質(zhì)子化和滯留,，一般后面處理細(xì)胞的弱堿性滲透劑不會逆轉(zhuǎn)染色效果。LysoTracker熒光可能在整個細(xì)胞內(nèi)熒光中占很小部分,，因此很難通過流式或熒光計定量溶酶體數(shù)量,。
LysoSensor探針
LysoSensor探針是細(xì)胞內(nèi)的pH熒光指示劑，可通過質(zhì)子化作用聚集在酸性細(xì)胞器內(nèi),。這個質(zhì)子化也減弱染料的熒光淬滅性,，從而增加熒光強度。因此,，與LysoTracker系列探針相比,，LysoSensor系列探針隨著細(xì)胞器的酸化程度增強，其熒光強度呈極大的pH依賴型(向酸)增強,。
產(chǎn)品選擇指南
注：探針標(biāo)記細(xì)胞后,，只能用熒光顯微鏡觀察,，而不能用流式或熒光酶標(biāo)儀檢測，因為在總細(xì)胞熒光中溶酶體熒光只占非常小的比例,。
產(chǎn)品特點
特異性強：高選擇性地識別和標(biāo)記靶向酸性細(xì)胞器,，幾乎不對線粒體染色；
種類齊全：多種熒光顏色可供選擇,、可與其他熒光染料或蛋白同時使用進行多色分析,；
簡單方便：自由滲透細(xì)胞膜，一步法染色,、標(biāo)記活細(xì)胞細(xì)胞器--溶酶體,，染料可快速導(dǎo)入；
靈敏度高：納摩爾濃度水平標(biāo)記活細(xì)胞的效果較高,。
染色結(jié)果
圖5A.4T1細(xì)胞染色結(jié)果圖,。綠色是FITC標(biāo)記細(xì)胞，紅色是LysoTracker Red DND-99 染色溶酶體,。
參考文獻：Di L, Yang A , Simin F , et al. Imidazole-Bearing Polymeric Micelles for Enhanced Cellular Uptake, Rapid Endosomal Escape, and On-demand Cargo Release[J]. AAPS PharmSciTech, 2018. 19(6), 2610–2619.
圖5B. Hela細(xì)胞染色結(jié)果圖,。(a) Lyso-Tracker Red DND-99染色Hela細(xì)胞；(b) Lysosensor Green DND-189染色Hela細(xì)胞
參考文獻：Zhang L, Chen X,, et al. Palladium nanoparticles induce autophagy and autophagic flux blockade in Hela cells. RSC Advances, 2018,8(8), 4130–4141.
FAQ
問題類別 | 問 | 答 |
實驗 咨詢 | 1.四種溶酶體探針的區(qū)別,？ | LysoTracker®--不依賴pH的活細(xì)胞溶酶體熒光探針（貨號40738和40739）,； LysoSensor™--依賴pH的活細(xì)胞溶酶體熒光探針（貨號40767和40768）。 |
2.LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO探針原理,？ | LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO)是一種pH依賴型顯示雙激發(fā)和雙發(fā)射波長的熒光探針：
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3.染色時,，細(xì)胞的狀態(tài)？ | 這四種探針是對活細(xì)胞中的酸性區(qū)室進行染色,。所以必須要在活細(xì)胞狀態(tài)下染色,。 | |
4.染色完成后，細(xì)胞是否能固定后再檢測熒光信號,？ | 固定后會破壞溶酶體的酸性環(huán)境從而會造成熒光減弱甚至消失的情況,，染色前后均不建議固定。 | |
5.可以和二抗一起孵育嗎,？ | 不可以,，孵育二抗必須要透化處理，而透化會破壞溶酶體的酸性環(huán)境,，影響染色效果,。 | |
6.這個探針可以染自噬溶酶體嗎 | 自噬溶酶體和正常的溶酶體在形態(tài)結(jié)構(gòu)上有較大差異，該探針主要是針對常規(guī)的溶酶體染色,，對于自噬溶酶體的染色效果不是很確定,，可以參考一些使用過該產(chǎn)品發(fā)表的文獻資料確定。 | |
7.植物細(xì)胞和組織適用嗎,？ | 理論上可以,，一般植物細(xì)胞或者組織要制成原生質(zhì)體,。 | |
8.可以染色其他酸性細(xì)胞器嗎？ | 可以染色其他酸性細(xì)胞器,，建議極低濃度下才能優(yōu)先選擇染色酸性溶酶體,。 | |
9.染色后可以放置一夜，再熒光檢測嗎,？ | 建議染色完立即檢測熒光,，時間過長，熒光信號會逐漸減弱,。 | |
10.用細(xì)胞培養(yǎng)基配成工作液以后穩(wěn)定嗎,？可以存放多久？ | 工作液是需要現(xiàn)配現(xiàn)用的,，不建議保存,。 | |
11.檢測儀器？ | 熒光顯微鏡,、共聚焦顯微鏡、酶標(biāo)儀,、流式細(xì)胞儀,。 | |
12.如何做到同時染色溶酶體和細(xì)胞核的？ | 建議用Hoechst 33258/ Hoechst 33342染色細(xì)胞核,，這個染料可以直接染活細(xì)胞不需要固定操作,。 | |
13.保質(zhì)期多久？ | -20℃避光保存,，半年有效,。 | |
實驗 問題 | 14.熒光信號較弱？ | 大致有3個原因： 1.溶酶體探針濃度過低,，建議適當(dāng)增大濃度,； 2.染色時間過短，建議延長染色時間,； 3.染色完之后,，放置過長時間才檢測信號；建議染色完立刻檢測,。 |
15．沒有熒光信號,？ | 大致有3個原因： 1.先用多聚甲醛、乙醛等固定細(xì)胞,，破壞了溶酶體的酸性環(huán)境,。 2.染色完后，又用多聚甲醛固定細(xì)胞,，或者透化細(xì)胞,，破壞了溶酶體的酸性環(huán)境,；染色前后均不建議固定細(xì)胞； 3.染色完到上機檢測這一段時間過長,，并且沒有避光處理,。建議避光染色，染色完立即檢測熒光信號,。 | |
16.在活細(xì)胞狀態(tài)下,，用50 µM探針染色50 min，然后發(fā)現(xiàn)除了溶酶體,，細(xì)胞質(zhì)中也有熒光信號,，這主要是什么原因?qū)е拢?/span> | 大致有一下3個原因： |
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LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO) 溶酶體黃/藍色熒光探針 | 40768ES50 | 50μL | 425.00 |
