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雙熒光素酶報(bào)告基因檢測數(shù)據(jù)集

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)因其具有靈敏度高、無細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)干擾等優(yōu)勢,，現(xiàn)已被廣泛用于基因表達(dá)調(diào)控的研究中,。該系統(tǒng)包括螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase）,，通過和底物的相互作用檢測基因的表達(dá)。通常海腎熒光素酶相對更多地被用作轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參，以消除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為螢火蟲熒光素酶的熒光值和海腎熒光素酶的熒光值的比值,。

雙報(bào)告檢測方法的應(yīng)用十分廣泛，如調(diào)控元件功能研究,、轉(zhuǎn)錄因子研究,、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、miRNA調(diào)控等,。通常把靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動子區(qū)克隆在luciferase的上游,，與海腎TK載體共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，以研究啟動子的強(qiáng)弱或轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用,；或把3’-UTR區(qū)克隆在luciferase的下游,，以研究miRNA對目的基因的調(diào)控作用。

該試劑盒主要應(yīng)用于動物細(xì)胞中,，當(dāng)然也有很多小伙伴用于植物中,，小翊這邊收集到了一些原始數(shù)據(jù)與大家分享。在這里分成動物細(xì)胞和植物兩個(gè)part,。以下案例均使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒完成（Yeasen,CAT:11402）,。

PartⅠ 動物細(xì)胞篇

1、驗(yàn)證鞘磷脂代謝中關(guān)鍵酶A的活性是否受關(guān)注基因X的影響,。

實(shí)驗(yàn)方案：在293T,、Caco-2和HIEC-6三種細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。將A酶基因啟動子連接在Luc上,，Luc-A,、

Ren載體和X基因的過表達(dá)載體（空載作為對照）共轉(zhuǎn)染，通過promega_ GloMax Multi Plus酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：從圖中結(jié)果可以看出,，基因X過表達(dá)可以提高A酶活性，證明基因參與調(diào)節(jié)鞘磷脂代謝,。

2,、驗(yàn)證cGAS150蛋白在293T里是否能激活干擾素通路。

實(shí)驗(yàn)方案：構(gòu)建IFN-β-Luc質(zhì)粒,，將其與Ren載體,、cGAS150過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。使用Promega GLOMAX 20/20LUMINOMETER酶標(biāo)儀進(jìn)行后續(xù)檢測,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：cGAS150蛋白可激活干擾素通路,。

3、Poly(I:C)是雙鏈RNA的類似物,，是一種干擾素的誘導(dǎo)劑,。驗(yàn)證其對干擾素X的調(diào)控作用,。

實(shí)驗(yàn)方案：構(gòu)建IFN-1-Luc載體，將其與Ren載體共轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞,，給予Poly(I:C)處理24h,。使用Promega;E5311酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：Poly(I:C)會誘導(dǎo)IFN-1的表達(dá),。

4、驗(yàn)證小鼠miR-1與靶基因3’UTR是否發(fā)生作用并進(jìn)一步確定miR-1與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn),。

實(shí)驗(yàn)方案：構(gòu)建Luc-3’UTR-WT載體和Luc-3’UTR-mut載體,，分別將它們與mimic NC/mimic miR共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。使用Promega酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：miR-1的作用靶點(diǎn)是 3’UTR,。

5、驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子NRF1的野生型以及突變體形式對于其靶基因A的啟動子序列的調(diào)控作用,，比較NRF1野生型以及突變體的轉(zhuǎn)錄活性差異,。

注：PGC-1α作為核轉(zhuǎn)錄輔助因子，可輔助NRF-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,，在一定程度上增加NRF-1的活性,。A則是被PGC-1α和NRF-1共同作用轉(zhuǎn)錄激活后轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體。研究發(fā)現(xiàn),，NRF-1通過與A基因啟動區(qū)反應(yīng)原件結(jié)合,，刺激A基因的轉(zhuǎn)錄。

實(shí)驗(yàn)方案：構(gòu)建Luc-A載體,，NRF1 WT/mut表達(dá)載體,，PGC-1α表達(dá)載體，將它們共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞,。使用Promega 9100-102（421）酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：NRF1的1,2，4,5號突變體對其轉(zhuǎn)錄活性有抑制作用,。

6,、驗(yàn)證小分子化合物9-cis-RA（sigma）是否為RXR的激動劑。

實(shí)驗(yàn)方案： 構(gòu)建pBind-RXR α-LBD載體,， 將其與 pG5 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,，同時(shí)用不同濃度的9-cis-RA（sigma）處理細(xì)胞。使用GloMax® Discover Microplate Reader_GM3000酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：9-Cis-RA是RXR的激動劑,，與文獻(xiàn)報(bào)道的相一致。

7,、驗(yàn)證IRF3轉(zhuǎn)錄因子與IFN-β啟動子的相互作用,。

實(shí)驗(yàn)方案： 構(gòu)建Luc-IFN-β載體,，將其與IRF3表達(dá)載體、Ren載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,。使用SpectraMax  L酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子IRF3對IFN-β啟動子起正調(diào)控作用。

8,、驗(yàn)證miR-375與A基因 3’UTR是否結(jié)合從而抑制A基因的表達(dá),。

實(shí)驗(yàn)方案：分別構(gòu)建Luc-3’UTR-WT載體和Luc-3’UTR-mut載體。將它們與mimic NC/mimic miR共轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,。使用POLARstar Omega酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：3’UTR-WT是miR-375的作用靶點(diǎn)。

9,、驗(yàn)證靶基因與基因組中的部分基因片段是否發(fā)生作用并進(jìn)一步確定這些基因與靶基因的作用位點(diǎn),。

實(shí)驗(yàn)方案：構(gòu)建pGL-3 pro-Gene載體及Target gene表達(dá)載體，將它們與Ren載體共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,。通過BERTHOLD centro XS3 LB 900酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：Target gene對Gene 1,4具有明顯的負(fù)向調(diào)控作用。

PartⅡ 植物篇

1,、驗(yàn)證在Y1H篩選后的6個(gè)不同轉(zhuǎn)錄因子,，對目標(biāo)基因的調(diào)控作用。

實(shí)驗(yàn)方案：構(gòu)建Luc-目標(biāo)基因啟動子載體和TF表達(dá)載體,，將它們與Ren載體轉(zhuǎn)化至擬南芥的原生質(zhì)體中,。通過MiKro Win2000酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：TF1-5對目標(biāo)基因上調(diào),，而TF6對目標(biāo)基因起抑制作用,。（Luc數(shù)值偏低，可以調(diào)整質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化比例,、提高原生質(zhì)體和底物的使用量）

2,、驗(yàn)證預(yù)測的3個(gè)擬轉(zhuǎn)錄因子對目標(biāo)基因的調(diào)控作用。

實(shí)驗(yàn)方案：構(gòu)建Luc-目的基因啟動子載體和TF表達(dá)載體,，將它們與Ren載體轉(zhuǎn)化至擬南芥的原生質(zhì)體中,。通過MiKro Win2000酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：GA16對目的基因起正向調(diào)控作用,；DE4和TX2起負(fù)向調(diào)控作用,。（Luc數(shù)值偏低，建議見上述案例）

3,、采用煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)的方法檢測TF在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性,。

實(shí)驗(yàn)方案：報(bào)告載體含有5× GAL4激活域，其下游連接 Luc 基因,；效應(yīng)載體含有TF基因,，其上游連接GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,，形成融合轉(zhuǎn)錄因子。將兩種載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌,，侵染煙草葉片,。侵染24-36h后，將葉片打孔成1.5cm左右的葉盤,。在2mL的EP管中放入3片左右的葉盤,，加入液氮，放入預(yù)冷的小鋼珠進(jìn)行研磨,。加入裂解液,，使用 SoftMax Pro Software（Molecular devices）酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：煙草雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示,，含有pBD-TF效應(yīng)載體的熒光值顯著高于陰性對照pBD和陽性對照（pBD-VP16）熒光值。結(jié)果表明TF是活性很高的轉(zhuǎn)錄激活因子,。

4,、驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子X能否結(jié)合到基因A和B的啟動子區(qū)域從而激活其表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)方案：構(gòu)建Luc-A/B和TFX表達(dá)載體,。將它們共轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中,，侵染煙草葉片。2天后,，將葉片打孔成1cm左右的葉盤,。取3片放入2mL EP管中，加入液氮進(jìn)行研磨,。之后加入裂解液進(jìn)行處理,。用Mithras(LB940)酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 轉(zhuǎn)錄因子X能結(jié)合到基因B的啟動子區(qū)域并激活其表達(dá)（p<0.005）,，但是無法結(jié)合到基因A的啟動子區(qū)域,。（Luc數(shù)值偏低，要確保研磨*,，加大裂解液的使用量）

以上就是小翊收集到的雙熒光素酶相關(guān)數(shù)據(jù)了,，希望對您有幫助。

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