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有時候,，qPCR實驗會成為阻礙你課題順利開展的強勢攔路虎,！看似簡單的基因表達量差異驗證,，當遇到低豐富表達的基因時,，也許就舉步維艱,。模板獲取困難導致的RNA提取量少或RNA質量不佳,，即使選用蕞佳的試劑,、篩選出良好的引物，也有可能qPCR定量得到的內參基因CT值在18-20個cycle,，而目的基因在31-35個循環(huán),。遇到這種情況，你是怎么解決的呢,？
qPCR在低豐度表達基因定量中的局限性
基因的豐度是指基因在基因組中的拷貝數,。可分為高豐度,，中等豐度和低豐度,。低豐度是指目的基因在基因組中的拷貝數低,可簡單認為2ng 總RNA中低于100個拷貝數的基因。從qPCR實驗結果來講,，當擴增效率為*,，模板加入量在1-10ng范圍內，qPCR得到的CT值高于28時即可認為低豐度基因,如下表所示,。
對低豐度表達和超低豐度表達的基因進行qPCR實驗,，會出現兩個難點：一是如何保證定量結果的準確性；二是如何對得到的結果進行數據分析,。
如何定量好低豐度目的基因,？
定量結果的準確性需要依賴定量實驗的合理設計。低豐度基因定量實驗常常出現以下情況：樣品復孔間重復性差（見下圖）,、PCR擴增效率低不能有效反映或接近基因的實際表達量,。
一,、如何保證定量結果的準確性
a. 保證復孔間的重復性
低拷貝基因在總RNA中的分布極不均勻，容易引起復孔間的誤差,，造成重復性差,。
建議：
1、在保證儀器等設備校準的情況下,，可以增加cDNA的稀釋倍數,，增加上樣體積，減少移液誤差,；
2,、增加復孔數，對偏差較大的數值予以舍棄,；
3,、還有一種方法就是引入一種不相關的carrier DNA(or RNA), 這些物質不跟目標基因發(fā)生反應，不干擾基因的檢測,，減少移液過程中靶基因粘壁或槍頭的損耗,。
b. 保證引物的擴增效率
qPCR擴增效率的要求是在90-110%。理論上,，每對引物均需要預實驗進行標準曲線確認擴增效率,，說到底qPCR反應包含模板，引物和反應試劑,，因此可從以下角度優(yōu)化擴增效率：
1,、模板質量的要求：模板純度低,，含抑制劑會抑制PCR擴增,，不利于qPCR實驗的進行。模板發(fā)生降解,，引物無法有效退火到目標區(qū)域,，也會造成擴增效率下降。高質量的模板從來都是進行qPCR實驗的要求之一,！
2,、優(yōu)化引物設計：常見的引物設計原則可自行百度。非特異性擴增會競爭消耗引物和Taq酶,，也會降低目標基因的擴增效率,。引物二聚體可參照下一條介紹。
3,、引物濃度優(yōu)化：引物濃度高,，模板濃度過低，會引起引物二聚體的形成,。對于低豐度基因而言,，引物二聚體與SYBR Green I結合產生的熒光,，會干擾背景值，造成試劑檢測靈敏度下降,！
4,、試劑的選擇：選用特異性好，檢測靈敏度高的qPCR預混液,。當然,，相對于二步法qPCR定量而言，選取一步法RT-qPCR無疑會有更好的靈敏度,，該方法將反轉錄和qPCR置于一管,，增加了檢測的靈敏度。
二,、如何對定量結果進行分析
下面我們從擴增效率角度和內參基因與目的基因△CT值的差異進行解釋低豐度基因定量數據的評判標準,。
a.當內參基因和目的基因的擴增效率一致，且擴增效率均接近100%：
1,、內參基因和目的基因的△CT值相差較大時,，如內參基因Ct值在20，目的基因Ct值在32,。
當遇到以上情況,，且實驗的樣本材料較或RNA純化量較少，可考慮以下分析方法,。
首先構建質粒標準品,，做標準曲線，測定TNF（目的基因）和HPRT（內參基因）擴增效率,，如下表,。
由上表可以看出，內參基因與目的基因的△Ct值相差均勻,，表明擴增效率接近,。
當研究“Jurkat cells were untreated or treated with PMA”，TNF表達量計算如下表：
可以看出,，以上數據直接按照正常的△△Ct法分析即可,。該分析方法的前提是qPCR試劑可準確定量超低濃度模板量。
2,、內參基因和目的基因的△CT值相差較?。ㄟm用于樣本RNA量多時）
當選用的qPCR試劑檢測范圍較小時，對低濃度模板不能準確定量,，可增加模板加入量,，使內參基因和目的基因均在試劑檢測的有效范圍。此時的關鍵在于選擇表達豐度和目的基因相近的內參基因,。內參基因的選擇依據有二：一是不受作用因素的影響且表達量相對恒定,；二是選取多個內參基因,，均一化誤差。下表列舉了常見的內參基因,，豐度從高到低,，根據目的基因表達豐度選取1-3個進行對照校正。
b.內參基因和目的基因的擴增效率不一致,，但均在90%-110%之間——雙標準曲線法
利用雙標準曲線法計算基因的相對表達量,。
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