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小翊君前幾期一直在和大家聊qPCR，今天我們開啟一個(gè)新的話題,，聊一聊反轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）定義:

反轉(zhuǎn)錄過(guò)程簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)是以RNA為模板合成DNA的過(guò)程,，是對(duì)中心法則的重要修正和補(bǔ)充,。
 

中心法則

    通常會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)不同的表述，逆轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄,，二者的本質(zhì)區(qū)別在于：反轉(zhuǎn)錄是在研究過(guò)程中人為提取RNA并以之為模板人工合成DNA的過(guò)程,。逆轉(zhuǎn)錄是RNA病毒自主行為，以RNA為模板形成DNA的過(guò)程,。前者發(fā)生在體外,，后者發(fā)生在體內(nèi)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的示意圖如下圖所示：
 

反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程

   看似簡(jiǎn)單的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn),，但也受到多種因素的影響,，如模板、引物,、酶以及反應(yīng)條件等,。接下來(lái)小編將帶您對(duì)其各個(gè)擊破。

一,、模板
 

① RNA自身結(jié)構(gòu)（高GC,、復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)）

RNA由于自身序列折疊，具有不同復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)：配對(duì)的雙鏈RNA呈螺旋,，發(fā)卡環(huán),，突環(huán)，內(nèi)環(huán),，多分支環(huán)等結(jié)構(gòu),。由于配對(duì)堿基不同，其配對(duì)的穩(wěn)性也不同,，如G與C之間的配對(duì),，三對(duì)氫鍵，為穩(wěn)定,。A與U為兩對(duì)氫鍵相互作用,；G與U為一對(duì)氫鍵相互作用，不穩(wěn)定,。故對(duì)于RNA模板來(lái)講,，GC含量越高,，二級(jí)結(jié)構(gòu)越為復(fù)雜。

在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中,，如下圖所示,，當(dāng)引物延伸到有二級(jí)結(jié)構(gòu)的地方，反應(yīng)就會(huì)被迫終止,，影響cDNA的合成長(zhǎng)度,。此時(shí)可建議先將模板進(jìn)行65℃孵育5min然后迅速冰上冷卻使二級(jí)結(jié)構(gòu)變性；同時(shí)可通過(guò)在較高的溫度下（如55℃）反應(yīng)以降低RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成,。
 

反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)延伸過(guò)程

② 純度和濃度的測(cè)定
 

RNA純度會(huì)很大程度地影響反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn),，如RNA純化過(guò)程中混入的鹽、金屬離子,、乙醇,、苯酚等均是常見的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。此外植物組織中的多糖多酚和腐殖酸等也會(huì)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶造成抑制作用,。

對(duì)于RNA純度的測(cè)定,，通常會(huì)選用Nano drop進(jìn)行測(cè)定。純度完好的RNA：1.8＜OD260/OD280＜2.0（＜1.8時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染,，可增加酚抽提,；＞2.0時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存）；OD260/OD230應(yīng)大于2,。（＜2表明有異硫氰酸胍,，β-巰基乙醇或乙醇的殘留；可進(jìn)行再次沉淀,，重復(fù)乙醇洗滌）,。

對(duì)于RNA濃度的測(cè)定，通常也會(huì)選用Nano drop進(jìn)行測(cè)定,。

③ 完整度
 

RNA的完整度在很大程度上影響著cDNA合成的長(zhǎng)度與質(zhì)量,。在進(jìn)行RNA提取處理儲(chǔ)存和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要采取特殊的保護(hù)措施，如操作者佩戴手套和口罩,，全程使用無(wú)RNA酶污染的實(shí)驗(yàn)耗材等,。

對(duì)于下游的克隆實(shí)驗(yàn)，RNA完整度將會(huì)影響cDNA的合成長(zhǎng)度,，從而影響目的基因的合成,。對(duì)于下游的目的基因定量實(shí)驗(yàn)，將會(huì)嚴(yán)重影響其CT值,，從而影響定量結(jié)果度（見下圖）,。
 

RNA RIN值和CT值的關(guān)系

     RNA的完整度通常會(huì)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于28S和18S rRNA的比值來(lái)評(píng)估RNA的完整度,，接近2:1為較為完整的RNA,。

目前,，Agilent 2100生物分析儀已逐漸成為RNA樣品質(zhì)量控制（QC）的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，在分析RNA完整性之后給出準(zhǔn)確的數(shù)值（RIN值）,，該值在8-10之間表示RNA質(zhì)量非常好，小于7時(shí)表示RNA完整度較差,。

④ gDNA的去除
 

在進(jìn)行下游qPCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中Totol RNA中混入的gDNA可直接作為PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增,，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性。因此在反轉(zhuǎn)錄之前必須要對(duì)RNA模板進(jìn)行去gDNA處理,，保證模板中僅有cDNA,。

那么如何解決呢？

我們可通過(guò)加入DNaseⅠ去除gDNA,。但是在反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)前需將DNaseⅠ滅活（通過(guò)高溫加熱或加入EDTA）,，否則該酶會(huì)將cDNA降解，但是高溫滅活DNaseⅠ會(huì)造成RNA的降解和損失,，加入EDTA滅活又會(huì)引入新的RNA酶抑制劑,。

Yeasen生物提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒含gDNA digester組分，在反轉(zhuǎn)錄之前可將其與RNA模板混勻42℃,，2min即可去除gDNA組分,，同時(shí)此試劑盒中的SuperMix 可終止gDNA digester的作用，保證cDNA的完整性,。

二,、引物
 

① Oligo(dT)

    Oligo(dT)引物是約12-18個(gè)多聚胸腺嘧啶T組成的重復(fù)寡核苷酸序列，能夠特異性地與真核生物mRNA的ploy(A)尾退火,，故不適合缺少ploy(A)尾結(jié)構(gòu)的RNA,，如原核生物RNA或microRNA，也不適用于已降解的RNA,，如FFPE樣品中RNA,。

真核生物中mRNA僅占總RNA的1%-5%左右，通常在進(jìn)行從真核生物中構(gòu)建cDNA文庫(kù),，或者克隆全長(zhǎng)cDNA以及3’RACE等研究時(shí)會(huì)優(yōu)先選擇 Oligo(dT)引物,。

對(duì)于復(fù)雜模板RNA，如含較多二級(jí)結(jié)構(gòu),，在進(jìn)行cDNA的合成延伸過(guò)程中,，當(dāng)延伸到二級(jí)結(jié)構(gòu)處時(shí)，可能會(huì)造成延伸終止,，若選擇Oligo(dT)可能會(huì)造成mRNA 5’端信息的丟失,。

② Random N6-N9
 

隨機(jī)引物是由隨機(jī)堿基組成的寡核苷酸，通常由6個(gè)核苷酸組成,，稱為隨機(jī)6聚體,。該種引物不具備特異性,，rRNA, tRNA,非編碼RNA，小RNA,，降解RNA,，復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA等都可以作為其模板。該類引物可提高cDNA的產(chǎn)量和濃度,，但是會(huì)使合成的cDNA長(zhǎng)度變短,。

③ 基因特異性引物
 

基因特異性引物能夠與模板特異性互補(bǔ)，產(chǎn)生目標(biāo)性很強(qiáng)的cDNA,，對(duì)于后續(xù)的PCR擴(kuò)增更特異,，適用于已知目的序列。通常應(yīng)用于一步RT-PCR反應(yīng),。當(dāng)使用基因特異性引物（GSP）無(wú)法有效合成鏈cDNA時(shí),，可選用Oligo(dT)或隨機(jī)引物。

三,、酶
 

不同的逆轉(zhuǎn)錄酶具有不同的功能活性,，表現(xiàn)出不同的逆轉(zhuǎn)錄效率，如合成cDNA的長(zhǎng)度,，產(chǎn)量,，對(duì)復(fù)雜模板的適應(yīng)程度等。通常共有的活性如下：

1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：以RNA為模板,，催化dNTP聚合形成DNA的過(guò)程,。

2）RNaseH活性：在反應(yīng)過(guò)程中切割RNA：cDNA雜合鏈中的RNA模板。降低此活性,，可避免在合成較長(zhǎng)cDNA之前模板RNA被降解掉,。

3）DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：以反轉(zhuǎn)錄合成的條cDNA單鏈為模板，再合成第二條cDNA分子,。

4）熱穩(wěn)定性：此性能是影響cDNA合成的重要因素,。升高反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的溫度，有助于高GC或復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)RNA模板的變性,，實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)cDNA的合成,。

5）保真性：RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA過(guò)程中的序列度。由于逆轉(zhuǎn)錄酶不具備3’-5’外切酶活性,，因此沒有校正功能,，所以合成的cDNA出錯(cuò)率較高。通常,，除測(cè)序?qū)Χ纫筝^高外,，其他情況下，反轉(zhuǎn)錄中引入的錯(cuò)誤數(shù)量可忽略不計(jì)，因?yàn)閏DNA中的錯(cuò)誤不會(huì)被放大,。

6）抗抑制能力：當(dāng)模板純度較低,、抑制物較多時(shí)，抗抑制能力強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶才能正常進(jìn)行cDNA的合成,。

目前使用的逆轉(zhuǎn)錄酶大都為MMLV（來(lái)源于莫洛尼鼠白血病病毒）,。未經(jīng)改造的MMLV適反應(yīng)溫度為37℃，有較低的RNaseH活性,。Yeasen生物對(duì)MMLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行改造,，提高其適反應(yīng)溫度（高溫下有利于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開），降低RNaseH活性,，提高cDNA合成長(zhǎng)度，增強(qiáng)其靈敏度和耐抑制能力,。改造結(jié)果見下圖：

 

逆轉(zhuǎn)錄酶的改造

各種逆轉(zhuǎn)錄酶的性能參數(shù)如下表：
 

反應(yīng)過(guò)程
 

反轉(zhuǎn)錄溫度通常推薦使用42℃,，對(duì)于高GC含量模板或者復(fù)雜模板，可將反轉(zhuǎn)錄溫度提高到50℃,。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng),，也可-20℃短期保存；若需長(zhǎng)期保存,，建議分裝后,，于-80℃保存，避免反復(fù)凍融,。

總之,，率的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)建立在高質(zhì)量的RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄酶,，合適的引物,，適宜的反應(yīng)條件等基礎(chǔ)上的。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意到所有的影響因素,，才能合成出適用于下游實(shí)驗(yàn)的高質(zhì)量cDNA,。

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