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這有一份FFPE樣本建庫的檔案,，還不趕緊Pick?
- 什么是FFPE？
FFPE（Formalin-Fixed and Parrffin Embedded）,，即福爾馬林固定石蠟包埋樣本,。由于這種處理方法能夠較長時(shí)間地保存組織或制備檢驗(yàn)所需的組織標(biāo)本，所以在臨床病理檢驗(yàn),、腫瘤基因檢測中應(yīng)用廣泛,。在世界范圍內(nèi)，大約有數(shù)十億份組織樣品保存在醫(yī)院或者組織樣品庫中,，其中絕大多數(shù)是使用福爾馬林固定石蠟包埋的方法處理的樣品,。
FFPE樣本通常代表了珍貴且來源廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究材料，為闡明疾病機(jī)制,、回顧性研究等提供了寶貴的資源,，但是由于樣本制備以及儲(chǔ)存等多方面的原因，F(xiàn)FPE樣本中的DNA質(zhì)量往往很差,。所以如何通過FFPE樣本中獲得的DNA建立合格的文庫已成為當(dāng)前測序研究領(lǐng)域亟待解決的問題,。
圖1 FFPE樣本
- 為何FFPE樣本中的核酸質(zhì)量差？
FFPE樣本特殊的制作方法和保存過程都會(huì)對(duì)核酸分子造成多方面的影響,。組織醫(yī)學(xué)樣本在離體后即開始發(fā)生降解,，福爾馬林的固定使組織中的核酸與核酸或核酸與蛋白之間交聯(lián)，石蠟的滲入過程進(jìn)一步加速核酸的降解,，保存時(shí)間及環(huán)境對(duì)樣品中的核酸也有極大的影響,。上述這些原因蕞終導(dǎo)致樣本中的核酸質(zhì)量受到嚴(yán)重的干擾和影響，比如假陰性和假陽性,。其中假陽性的出現(xiàn)對(duì)于基因檢測,，尤其是低頻突變的檢測會(huì)造成很大的干擾。
表1 影響FFPE樣本中DNA質(zhì)量的主要因素
因素 | 結(jié)果 |
核酸與蛋白發(fā)生交聯(lián) | 影響核酸提取的質(zhì)量 |
磷酸二脂鍵的水解 | 導(dǎo)致DNA的片段化 |
胞嘧啶脫氨基 | 引入C→T,，G→A等突變 |
- 如何提高FFPE樣本的建庫質(zhì)量,？
1. 樣本質(zhì)量控制
對(duì)于高質(zhì)量的DNA樣本，通過吸光度檢測樣品純度（Nanodrop）和熒光定量（Qubit）進(jìn)行質(zhì)量檢測即可,，但是這對(duì)于FFPE樣本來源的DNA是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,， 需要進(jìn)一步的質(zhì)控評(píng)估。目前主要的方法有以下兩種：
1）通過對(duì)廣泛存在于gDNA的Alu序列（Alu 247與Alu 115）的qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物比值來衡量DNA的完整性,；
注：Alu247/Alu115：Alu序列是廣泛分布于人基因組的約300bp短重復(fù)序列,。通過長 (247 bp; Alu247) 、短(115 bp; Alu115) 擴(kuò)增子比值可評(píng)估gDNA的完整度,。
Q Score：即Quality Score,，是指不同qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物濃度的比值,。常用的Q129/Q41和Q305/Q41比值分別指129bp和41bp產(chǎn)物、305bp和41bp產(chǎn)物濃度比值,。
2) DIN：即 DNA Integrity Number,，是指DNA經(jīng)安捷倫生物分析系統(tǒng) 2200/4200 TapeStation分析并計(jì)算的出的數(shù)值，是對(duì)DNA完整性的評(píng)分,。
表2 FFPE樣本質(zhì)控參數(shù)
原理 | 質(zhì)控參數(shù) | 理想樣本參數(shù)值 | 高質(zhì)量FFPE樣本值 |
使用不同長度的引物來擴(kuò)增大量存在于人類基因組中的序列,， 根據(jù)其qPCR產(chǎn)物的比值評(píng)估 | Alu 247 / Alu 115 | 1 | 0.4 |
Q129/Q41, Q305/Q41 | 1 | Q129/Q41>0.4 | |
Agilent | DIN | 9.8 | >3.5 |
2. 樣本損傷修復(fù)
FFPE樣本由于制作與儲(chǔ)存等多方面的原因?qū)е聵颖举|(zhì)量不佳，如果質(zhì)控之后樣本質(zhì)量很差,，可對(duì)樣本DNA進(jìn)行修復(fù),。通常修復(fù)液由不同的酶類根據(jù)不同比例混合而成，能夠?qū)NA樣本中胞嘧啶脫氨成尿嘧啶,、切刻或者缺口等問題能夠進(jìn)行修復(fù),，進(jìn)而從整體上提升建庫成功率。
表3 FFPE 修復(fù)試劑作用
損傷類型 | 是否修復(fù) |
胞嘧啶脫氨成尿嘧啶 | √ |
切刻與缺口 | √ |
堿基氧化 | √ |
3’端封閉 | √ |
DNA//片段化 | × |
核酸蛋白交聯(lián) | × |
通常情況下,，F(xiàn)FPE修復(fù)試劑可以通過對(duì)樣本的修復(fù)顯著提高低質(zhì)量FFPE樣本的建庫產(chǎn)出,，而對(duì)高質(zhì)量FFPE樣本的建庫產(chǎn)量提升并不明顯（如下圖所示）。
圖2 FFPE修復(fù)試劑盒對(duì)建庫產(chǎn)量的影響（Input DNA: 10 ng; Cycles：10）
數(shù)據(jù)來源于翊圣UltimaTM DNA建庫試劑盒（Cat12199）測試結(jié)果,，F(xiàn)FPE修復(fù)試劑為翊圣FFPE DNA Repair Reagent(Cat#12606)
3. 樣本建庫
的建庫試劑盒能夠蕞大程度的利用有限的樣本,，使其轉(zhuǎn)化為合格的文庫。FFPE樣本由于樣本濃度更低,，質(zhì)量較差,，往往對(duì)試劑盒的要求也更高，搭配更的建庫試劑盒也成為了FFPE樣本建庫的*之選,。
建庫試劑盒的效率評(píng)估指標(biāo)主要3個(gè)方面：
NGS建庫文庫轉(zhuǎn)化率：指文庫中兩端都連上接頭的目的片段占總片段數(shù)的比值,。文庫轉(zhuǎn)化率影響文庫的多樣性與文庫的質(zhì)量，高的文庫轉(zhuǎn)化率一定程度上意味著文庫豐度與測序的覆蓋度更好,，尤其是在FFPE樣本中可能出現(xiàn)一些其他類型損傷的情況下,，轉(zhuǎn)化率過低勢必會(huì)影響蕞終文庫的產(chǎn)出與文庫的豐度。
圖3 雙端連接的文庫通過橋式擴(kuò)增成簇
文庫擴(kuò)增均一性：指的是讀取數(shù)據(jù)在基因組或目標(biāo)區(qū)域的分布均一程度,。其生信分析圖如圖4所示,，一般認(rèn)為覆蓋越均勻，達(dá)到特定深度所需的測序數(shù)據(jù)就越少,，覆蓋均一性的偏向通常是在DNA片段化和文庫擴(kuò)增步驟中引入的,。
圖4 不同GC含量樣本測序數(shù)據(jù)均一性
文庫擴(kuò)增效率與保真性：文庫擴(kuò)增效率即獲得特定文庫產(chǎn)量所需的循環(huán)數(shù)，循環(huán)數(shù)越低意味著擴(kuò)增效率越高,；保真性即PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)堿基錯(cuò)配的數(shù)量,，相同循環(huán)數(shù)條件下，錯(cuò)配數(shù)量少則保真性越高,。
- 十年匠心品質(zhì),，只為一顆初心——UltimaTM,，就是你要的檔案
Hieff NGS® Ultima DNA Library Prep Kit（Cat#12199）是翊圣生物針對(duì)Illumina測序平臺(tái)研發(fā)的DNA建庫試劑盒，本品采用高質(zhì)量酶學(xué)組成,，具有優(yōu)異的文庫轉(zhuǎn)化率與擴(kuò)增效率,，*解決FFPE/cfDNA建庫難的問題。多樣本驗(yàn)證,，同等條件下文庫產(chǎn)量是K*品牌的1-3倍。適用于常規(guī)動(dòng)植物基因組,、微生物基因組,、FFPE、cfDNA,、ChIP DNA等所有樣本建庫,，助力獲得優(yōu)異的測序數(shù)據(jù)。
精簡流程：末端修復(fù)與A尾巴添加一步完成,，無需純化,，大大縮減建庫時(shí)間；
極的DNA連接酶： 自主創(chuàng)新研發(fā)DNA連接酶Fast T4 DNA Ligase,，多樣本驗(yàn)證連接效率是N*品牌的2-3倍,；
強(qiáng)擴(kuò)增效率的高保真酶：自主創(chuàng)新研發(fā)強(qiáng)擴(kuò)增效率高保真酶Canace®Ⅱ，極大降低文庫擴(kuò)增帶來的偏好性,。性能媲美K*品牌H*Fi酶,；
圖5 UltimaTM建庫試劑盒多樣本驗(yàn)證均可獲得優(yōu)異的文庫質(zhì)量
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