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什么是DNA甲基化
DNA甲基化（DNA methylation）是DNA化學修飾的一種形式,，能夠在不改變DNA序列的前提下改變遺傳表現。DNA甲基化是指在DNA甲基化轉移酶的作用下,，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價鍵結合一個甲基基團,。DNA甲基化的結果，一般是使甲基化位點的下游基因表達量變少,。
圖1：DNA甲基化原理圖
為什么研究DNA甲基化
DNA 甲基化是早發(fā)現的基因表觀修飾方式之一,，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化在維持細胞正常功能,、傳遞基因組印記,、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用，比如DNA甲基化能關閉調控細胞生長基因的功能,，導致細胞壞死或過度增值,；此外，DNA甲基化還能引起染色質結構,、DNA構象,、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達,。目前DNA甲基化已成為表觀遺傳學和表觀基因組學的研究熱點,。
圖2：DNA甲基化的應用
DNA甲基化與高通量測序
甲基化機制的發(fā)現，使DNA甲基化的研究受到了廣泛關注,，從醫(yī)學領域擴展到動植物研究領域,，同時在研究方法上也取得了很大突破。目前用于DNA甲基化檢測的方法大致可分成兩類：全基因組甲基化分析和特異位點甲基化檢測,。以上兩類方法都是通過高通量測序來完成的,，它不僅能夠覆蓋所有甲基化位點，還可以配合靶向技術檢測低頻甲基化信號,，使我們能夠從全基因組水平來分析5’甲基胞嘧啶及組蛋白修飾等事件,，這就是所謂的“DNA甲基化測序”。
圖3：甲基化DNA測序圖
DNA甲基化建庫
經過甲基化修飾的DNA序列是不會改變的,，常規(guī)建庫的測序不能檢測到甲基化位點,，因此需要在建庫過程中對發(fā)生甲基化的位點進行標記區(qū)分。目前全基因組重亞硫酸氫鹽測序(WGBS或BS-Seq,，Whole Genome Bisulfate Sequencing)是甲基化測序的*準則,，市場上的甲基化建庫試劑盒也都是基于此原理研發(fā)出來的。
說到DNA甲基化建庫,，我們先來看一下常規(guī)的DNA建庫流程,，詳情請參考——劃重點！NGS中DNA建庫方法全面解析
主要流程：DNA //片段化——末端修復——A尾添加——接頭連接——PCR擴增
圖4：DNA文庫構建
與常規(guī)DNA建庫相比,，甲基化建庫主要是在原有步驟的基礎上增加一步重亞硫酸氫鹽轉化，對應原理如下：
重亞硫酸氫鹽轉化
在弱酸性條件下,，亞硫酸氫根會結合到沒有甲基化的C堿基的第6位,，而甲基化了的C堿基不會和亞硫酸氫根發(fā)生反應。之后,，用堿處理,，結合了亞硫酸氫根的非甲基化的C會發(fā)生脫氨基，脫亞硫酸根,，被轉化成U堿基,，甲基化的胞嘧啶保持不變，還是C。
圖5：亞硫酸氫鹽轉化原理圖
經亞硫酸氫鹽轉化過的DNA,，再經過PCR,，PCR新合成出來的鏈，對應U堿基的位置就會被替換成了“T”,。在接下來的測序過程中,，測到的也是T堿基。后,，我們只需看一個位置是“C”,，還是“T”，就可以區(qū)分該位點是否被甲基化 ,。
圖6：DNA甲基化測序對應堿基
目前對應的甲基化建庫方法主要分為以下兩類：
I：選擇甲基化處理過的特異性接頭,，在文庫構建好后用重亞硫酸氫鹽轉化，然后上機測序
DNA //片段化——末端修復——A尾添加——特殊接頭連接——PCR擴增——重亞硫酸氫鹽轉化
II：DNA //片段化后直接用重亞硫酸氫鹽轉化,，然后按照正常的DNA 建庫操作,。
DNA //片段化——重亞硫酸氫鹽轉化——末端修復——A尾添加——接頭連接——PCR擴增
兩種方法都有各自對應的優(yōu)缺點，主要如下：
| 方法I | 方法II |
優(yōu)點 | PCR循環(huán)數較少,，文庫不均一程度較低,，PCR bias較少。 | 建庫的豐富程度比較高 |
缺點 | 在用亞硫酸氫鹽處理DNA文庫的時侯,，90%以上的DNA鏈會斷掉,。文庫的豐富度就會損失90%以上。 | 較多的PCR循環(huán),，產物的擴增均一性是不太好的,，PCR bias會比較大。 |
溫馨提示：
1.設置內參：在甲基化文庫建程當中,，亞硫酸氫鹽對未甲基化的C的轉化效率并不是100%,，一般是在99%左右。為了對實驗的轉化效率進行質量控制,。建議在轉化實驗當中加入內參對照品,。一般情況下，實驗當中是加入1%的*沒有甲基化的λ DNA做內參,，主要是甲基化酶缺陷型的大腸桿菌,，所生產出來的*沒有被甲基化的λ（噬菌體）DNA，或者pUC19（質粒）DNA做內參,。
2.濃度測定：經過重亞硫酸鹽處理后的基因組DNA,，由于其中非甲基化的“C”會轉化為“U”，所以回收后的DNA會是一種“A”,“T”和“U”占大部分的核酸分子,，而且當初的堿基配對形式也不復存在,，取而代之的是主要以單鏈形式和非特異性配對形式存在的特殊核酸形態(tài)，這種形態(tài)的核酸在OD260處的吸光值與RNA更為相似，所以純化后基因組DNA的OD260值為1時,，則相當于大約40 μg/ml的核酸濃度,。另外，基于處理后核酸狀態(tài)的特殊性,，其OD230測值會出現異?，F象，可能導致OD260/OD230比值不穩(wěn)定,，這種情況不會影響后續(xù)的PCR反應,。
3．上機測序：為了彌補甲基化文庫的堿基不平衡性，一般情況下,，在上機過程當中,，摻入大比例的基因組文庫，或者PhiX文庫,，來補充比較多的C堿基,，一般會摻30%的PhiX文庫、或者基因組文庫,。
