實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中雞產(chǎn)氣莢膜梭菌壞死性腸炎毒素B(NetB)水平。用純化的雞產(chǎn)氣莢膜梭菌壞死性腸炎毒素B(NetB)抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入產(chǎn)氣莢膜梭菌壞死性腸炎毒素B(NetB)，再與HRP標記的產(chǎn)氣莢膜梭菌壞死性腸炎毒素B(NetB)抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,，經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的產(chǎn)氣莢膜梭菌壞死性腸炎毒素B(NetB)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標準曲線計算樣品中雞產(chǎn)氣莢膜梭菌壞死性腸炎毒素B(NetB)濃度,。

試劑盒組成

標本要求

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

操作步驟

1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋,。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）、標準孔,、待測樣品孔,。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復5次，拍干,。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl,，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3,。

8. 洗滌：操作同5,。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色10分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。

11. 測定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行,。