由于
鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體快速,、低成本,、可操作性、靈敏度和選擇性等優(yōu)點(diǎn),，免疫分析法被廣泛用于檢測(cè)食品和環(huán)境中的污染物,。以大限度地提高檢測(cè)靈敏度已成為免疫測(cè)定方法的研究熱點(diǎn)。就免疫分析原理而言,，提高檢測(cè)靈敏度主要有兩種方法,。開發(fā)各種抗原與抗體相互作用的信號(hào)放大系統(tǒng)是一種常見且有效的提高靈敏度的策略，如熒光底物信號(hào)放大和化學(xué)修飾信號(hào)放大,。另一種提高抗體對(duì)抗原的親和力。傳統(tǒng)抗體通過免疫動(dòng)物產(chǎn)生的親和力提高受到免疫耐受的限制,。由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu),，這些抗體也不適合體外親和成熟。相比之下,便于基因操作的基因工程抗體非常適合高親和力的抗體在體外成熟基因工程和蛋白質(zhì)工程的進(jìn)步,，如單鏈可變片段和單域抗體(sdAb),。sdAb又稱納米體(nanobody,Nb),，由于其納米尺度的大小、良好的水溶性和對(duì)惡劣環(huán)境的高耐受性,，而因此具有很高的研究?jī)r(jià)值,。sdAb通常來源于駱駝科的重鏈抗體和軟骨魚的免疫球蛋白新抗原受體的可變區(qū)域，分別命名為VHH和VNAR,。從三種噬菌體顯示的sdAb文庫中可以篩選出特異性的sdAb,，包括免疫文庫、天然文庫和半合成/合成文庫,。免疫庫通常用于篩選高親和力的sdAbs,，目前已有大量的sdAbs被開發(fā)用于食品和環(huán)境檢測(cè)分析。此外,，sdAbs的單區(qū)域特性有利于基因修飾,，不同工程化的sdAbs包括體外抗體成熟提高親和度的sdAbs、融合酶的sdAbs,、帶肽標(biāo)記的sdAbs,。如體外親和成熟的sdAb,研究表明，定向修飾獲得突變體sdAbN-28-t102y,，該突變體親和度比親本sdAbN-28高3.2倍,，在90℃，熱處理5分鐘后性保持55%,。
體外誘導(dǎo)鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體親和成熟的方法有很多,，包括易錯(cuò)PCR、DNA重組,、鏈重組,、UV或化學(xué)誘變等。但突變的隨機(jī)性使選擇費(fèi)時(shí)費(fèi)力,，限制了這些方法在體外抗體親和成熟中的廣泛應(yīng)用,。將計(jì)算模擬與高通量篩選技術(shù)相結(jié)合，可以高效獲得親和力更高的配體結(jié)合蛋白,。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性是計(jì)算模擬蛋白質(zhì)與配體相互作用的關(guān)鍵,。獲得蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的方法有很多種，如x射線晶體學(xué),、核磁共振光譜和冷凍電鏡等,。然而，由于成本高,、實(shí)驗(yàn)條件苛刻,、過程耗時(shí)、勞動(dòng)密集型,，這些方法沒有得到廣泛應(yīng)用,。蛋白質(zhì)同源建模是一種簡(jiǎn)單有效的為結(jié)構(gòu)未知的給定蛋白提供結(jié)構(gòu)模型的方法,。比對(duì)搜索工具(BLAST)用于搜索同源序列，然后通過服務(wù)器建模,，如SWISS-MODEL,、3D-Jury、I-TASSER和MODELLER瑞士模型,。此外,，SWISS-MODEL將定性模型能量分析(QMEAN)估計(jì)與質(zhì)量估計(jì)(GMQE)評(píng)分相結(jié)合，提供了一種綜合的質(zhì)量評(píng)估,，有助于獲得更準(zhǔn)確的模型,。此外，利用同源建模和分子對(duì)接的組合策略可以預(yù)測(cè)蛋白功能,，分析抗體和抗原的分子間相互作用,，這將有助于提高重組抗體在體外成熟的親和力。
研究表明,，鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體通過同源建模,、分子對(duì)接和丙氨酸掃描來識(shí)別用于OTA的sdAbNb28中的4個(gè)關(guān)鍵氨基酸(Gly53、Met79,、Ser102和Leu149),。這些氨基酸配對(duì)組成兩個(gè)two-site飽和突變庫，突變后的Nb-G53Q&S102D親和力高于1.36倍,。結(jié)果表明,，同源性建模和分子對(duì)接結(jié)合丙氨酸掃描和雙位點(diǎn)突變適用于生成提高sdAbs親和力。由于sdAbs具有納米尺寸,、單疇,、易于表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用核磁共振,、x射線晶體結(jié)構(gòu)分析,、低溫電子顯微鏡等技術(shù)可以有效地獲得sdAbs的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)，并準(zhǔn)確分析sdAbs與靶分子的相互作用,。相比之下,，目前使用的同源建模和分子對(duì)接方法成本低、省時(shí),。因此,，本研究為提高AOA-sdAb的結(jié)合親和力提供了有效策略。
會(huì)員.png)
9
立即詢價(jià)
您提交后,，專屬客服將第一時(shí)間為您服務(wù)