前言

      無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一旦生長直徑超過1~2 mm,，都會有血管生成,。這是由于腫瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長因子，誘導(dǎo)血管生成。多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長迅速,。因此,，血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用,，抑制這一過程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴散轉(zhuǎn)移,。于是體外的血管生成實驗就能很好的模擬腫瘤的血管發(fā)生過程，并且適合研究藥物對這一過程的影響實驗,。本實驗以HUVEC細(xì)胞為例,，介紹這一實驗的詳細(xì)過程。

圖一  血管生成鏡檢圖

一.實驗材料和實驗方法

1.實驗材料

2.實驗方法：
2.1實驗流程介紹

圖二  實驗流程圖

（提前將Matrigel融化,，鋪于ibidi血管生成載玻片的下孔中,，待膠凝后，將細(xì)胞懸液加入血管生成載玻片上孔中,，成管后使用顯微鏡觀察,。）

2.2耗材結(jié)構(gòu)介紹

圖三   血管生成載玻片縱截面示意圖

（Matrigel鋪在下孔，細(xì)胞鋪在Matrigel上,，上孔充滿培養(yǎng)基）

2.3數(shù)據(jù)分析流程介紹

圖四  實驗結(jié)果收集和分析流程圖

（在特定的時間點采集圖片,，并且進(jìn)行圖像分析（Wimasis全自動分析）測量小管長度，成環(huán)數(shù),，細(xì)胞覆蓋面積和結(jié)點,。之后在對測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析以說明實驗結(jié)果。）

二,、實驗步驟

1,、準(zhǔn)備基質(zhì)膠

1. 實驗前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4,。C冰箱,，使膠能緩慢融化。（注意：同樣要準(zhǔn)備一些4,。C預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）

2.開始實驗前,，將Matrigel始終保持放在冰盒中。

3.打開滅菌包裝,，取出ibidi血管生成載玻片,。

4.每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel,，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠,。

由于Matrigel流動性不強，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確,，有可能打入10μl的膠,，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣，必然會影響到實驗的成像結(jié)果。

如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：

我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿,。

如上圖所示,，垂直透過每個孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了,，那么就說明膠沒加滿,，格子被放大了，那么膠就加多了,，格子沒發(fā)生什么變形,，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

3,、凝膠

1. 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子,。
2. 準(zhǔn)備一個10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾,，制成一個濕盒,。
3. 將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋,。
4. 將整個培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中,，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié),。
5. 等待同時準(zhǔn)備細(xì)胞懸液,。

3、鋪細(xì)胞

加入細(xì)胞的量直接影響實驗結(jié)果,，所以在正式實驗開始之前,，要對不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實驗。獲得佳比例的細(xì)胞密度,。我們今天的實驗使用HUVEC細(xì)胞,，每孔種10000個細(xì)胞即可。

1. 準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液,，充分混勻,。
2. 將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
3. 每孔加入50μl的細(xì)胞懸液,，注意保持槍頭垂直在上孔的上方,，不要接觸下孔的凝膠?？梢允褂门艠?。
4. 同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有,，加入無細(xì)胞的培養(yǎng)基,，使上孔液體正好加滿,。
5. 蓋上蓋，靜置,，一段時間后,，所有細(xì)胞都會沉下去落在Matrigel的表面。

?

?4,、采集圖像并統(tǒng)計結(jié)果
可以按照細(xì)胞的生長速度定時采集圖像,，并且對其成管長度，覆蓋面積,，成環(huán)數(shù),，結(jié)點數(shù)進(jìn)行測量和記錄,，并且對其進(jìn)行統(tǒng)計分析,。

5、免疫熒光染色
根據(jù)需要,，可以對成管結(jié)果進(jìn)行免疫熒光染色,。
小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基，注意不要碰到膠或者細(xì)胞網(wǎng)絡(luò),。
加入50μl用無血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl),，使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)。
在室溫下避光孵育30分鐘,。
使用PBS清洗三次,，注意，PBS要緩緩加入上孔,，以免沖擊掉細(xì)胞,。
使用 485 nm/ 529 nm進(jìn)行免疫熒光成像。

實驗優(yōu)勢

1.這個實驗方法能節(jié)省更多基質(zhì)膠,，降低實驗成本,；

2.分上下孔的ibidi血管生成載玻片能去除凹液面，使成像效果更好,。

圖五  成像對比

（左側(cè)ibidi血管生成載玻片無凹液面,，整個視野成像清晰；右側(cè)96孔板有凹液面,，中間清晰周圍模糊,。）