卡西波肉瘤是一種發(fā)生在包括口腔在內(nèi)的多種組織內(nèi)的,，具有*的血管生成能力和侵襲能力的惡性腫瘤,。卡西波肉瘤KS已經(jīng)被鑒定出多種細胞標記物,，但是其來源依然是一個迷。美國的科學家之前發(fā)現(xiàn)卡西波肉瘤相關的皰疹病毒（KSHV）能夠使大鼠的原代間充質干細胞（MSCs）感染,，變形,，并且重新編輯，使其分化為類卡西波肉瘤細胞。在這次的實驗中,，科研人員使用KSHV感染由多種組織來源的人原代間充質干細胞,，包括骨髓（MSCbm）,，脂肪組織（MSCa）,，牙髓,，牙齦組織（GMSC）,，和乳牙,?？蒲腥藛T成功的建立起來KSHV感染的MSCa,，MSCbm和GMSC（LTC-KMSCs）的穩(wěn)定株,。其中,，這些細胞表達了混合的KS標記物,，并且顯現(xiàn)出不同的血管生成,、侵襲和變形的現(xiàn)象，而LTC-KMSCs表現(xiàn)出比未感染細胞更低的增殖率,。進而研究人員發(fā)現(xiàn)KSHV介導的血管生成是通過KSHV介導的microRNA激活了AKT通路,。這些研究說明,，在人體內(nèi)MSCs是KSHV的靶細胞,，會建立起多種KSHV感染的模型,。

研究人員采用各種MSCs,，鋪在基質膠上,，孵育8小時,，對比不同細胞的分枝數(shù)和節(jié)點數(shù)。

Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome

L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu

Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857

（一）實驗材料和實驗方法

1）細胞：  MSCs     ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) or Lifeline Cell Technology (Frederick, MD)

2）培養(yǎng)基：      MSC medium         (MSCM; ScienCell Research Laboratories)

3）基質膠：    Matrigel Basement membrane       (BD)    10 µl per well

4）耗材：    ibidi血管生成載玻片  (ibidi, 81506)

5）其他：        細格紙                                  

（二）實驗步驟

1）準備基質膠

①　將10μl的Basement membrane以5mg/ml的濃度鋪入ibidi血管生成載玻片的內(nèi)孔中，注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel,，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠,。

②　蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。

③　準備一個10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾,，制成一個濕盒。

④　將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中,，蓋上培養(yǎng)皿蓋。

⑤　37℃至少孵育30分鐘,，使基質膠固化,。

怎么知道加了合適體積的Matrigel：

由于Matrigel流動性不強，并且有可能移液槍不準確,，有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔,，這樣,，必然會影響到實驗的成像結果。這時用一張格子紙就能知道移液槍調整到多少能正好把下孔填滿,。

如上圖所示,，垂直透過每個孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了,，那么就說明膠沒加滿,，格子被放大了，那么膠就加多了,，格子沒發(fā)生什么變形,，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

3）鋪細胞

①　每孔種10000個細胞即可,。準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液,，充分混勻。

②　將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出,。

③　每孔加入50μl的細胞懸液,，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠?？梢允褂门艠?。

④　同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有,，加入無細胞的培養(yǎng)基,，使上孔液體正好加滿。

⑤　蓋上蓋,，靜置,，一段時間后，所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面,。

4）采集圖像并統(tǒng)計結果

37度 5% CO2孵育8小時后,，使用尼康Eclipse E400熒光顯微鏡采集圖像，并其分枝數(shù)和節(jié)點數(shù)進行測量和統(tǒng)計,。

三）實驗結果

對比LTC-KMSCs幾種細胞的成管效果,。Mock是未被病毒感染的間充質干細胞，KSHV會增強血管形成效果,。圖像是鋪細胞后8小時采集,，100倍放大倍數(shù)。

1. 為了研究KSHV相關的miRNA的作用,，對比了未被感染MSCs（Mock）,，感染的MSCs（KSHV）和用10個pre-miRNA簇缺失的突變病毒感染的MSCs（ΔmiR）和用這一突變的KSHV穩(wěn)轉的MSCs（ΔmiR Vector）；以及用逆轉錄病毒重新表達這10個miRNA簇（ΔmiR Cluster）這幾組細胞的血管生成,。發(fā)現(xiàn)這幾個miRNA對于細胞的血管形成有著非常重要的作用,。(B) LY294002一種磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的抑制劑,，對于LTC-KMSCa血管形成有明顯的抑制作用,。并且隨著LY294002濃度的上升，抑制作用會增強,。兩組結果均是鋪細胞8小時后以100倍放大倍數(shù)采集圖像。