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PCR原理

　　DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下,，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝,。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈,。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,，加入設(shè)計引物,，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制,。
　　但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴,，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,。
　　發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,，PCR技術(shù)得以大  taq酶[1]量應(yīng)用,，并逐步應(yīng)用于臨床。
　　PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈,，重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘,，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

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