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OVCAR5細(xì)胞 OVCAR5細(xì)胞 卵巢癌細(xì)胞（細(xì)胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種,，分別是細(xì)菌污染、支原體污染,、原蟲污染,、黑膠蟲污染、真菌污染,、病毒污染以及非細(xì)胞污染,，那么他們污染細(xì)胞的特點(diǎn)分別是什么呢？怎樣能夠減少污染現(xiàn)象的發(fā)生,？）

1-細(xì)菌

細(xì)菌污染常見的有大腸桿菌,，葡萄球菌等。細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn),，在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀,，培養(yǎng)液一般會(huì)在短時(shí)間內(nèi)變黃，有時(shí)靜置的培養(yǎng)液不混,，稍加震蕩會(huì)有很多混濁物漂起,。顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時(shí)在細(xì)胞表面及周圍有大量細(xì)菌存在,，細(xì)胞停止生長并有中毒表現(xiàn),。

處理：①在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的抗生素，能夠預(yù)防絕大多數(shù)的細(xì)菌污染,。

2-真菌

真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中zui常見的一種，尤其梅雨季節(jié)快要到了,，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)更易污染,。污染細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉,、毛霉菌,、孢子霉、白念珠菌,、酵母菌等,。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見,，較易被發(fā)現(xiàn),，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細(xì)胞之間縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀,、管狀,、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中,。

很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠,；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形,，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。鏡下看時(shí),，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈,，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。

真菌污染后,，細(xì)胞生長變慢,，但zui后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。真菌生長的比較慢,，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn),，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了,。

3-支原體

支原體的大小介于細(xì)菌和病毒之間,，是一種獨(dú)立生活的微生物。對熱敏感,，對一般抗生素不敏感,。支原體的形態(tài)多變，多吸附在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間,。電鏡下觀察,，中心有高密度的密集顆粒，橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似,。

因國內(nèi)的血清大多數(shù)都沒有做支原體陰性檢測,，而支原體又是牛血清中zui常見的微生物之一。支原體污染細(xì)胞后,，培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁．但細(xì)胞變化不顯著,，隨著細(xì)胞的培養(yǎng)會(huì)慢慢死亡。

支原體污染檢測（熒光染色法）：DNA和與DNA特異性結(jié)合的熒光染料結(jié)合,，使得支原體的DNA著色,，然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn),。

解決：

1）抗生素排除法：支原體污染預(yù)防比解決好,。如果不小心污染后，可加入高濃度抗生素（常規(guī)使用的5倍濃度）作用24-48小時(shí),，再換入常規(guī)培養(yǎng)液,，但該法不保證有效。推薦用量：慶大霉素 200μg/ml ,四環(huán)素10μg/ml ,，卡那霉素50μg/ml ,。

2）加溫除菌：支原體不耐熱，可以對支原體污染的細(xì)胞熱處理除菌,。因高溫對細(xì)胞本身也會(huì)產(chǎn)生一定影響,，故熱處理前需先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),，確定對細(xì)胞影響zui小而能zui大程度的殺死支原體的時(shí)間。

4-黑膠蟲

黑膠蟲的存在目前尚有爭議,，其在低倍下為黑色點(diǎn)狀,，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的,，對細(xì)胞生長狀態(tài)不會(huì)有明顯影響,，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無須特殊處理,。

5-原蟲

培養(yǎng)液可輕微渾濁,，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多，輕微活動(dòng),，細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢,，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚,，細(xì)胞不透亮,。他們與細(xì)胞可共生但會(huì)與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的,，但他們的數(shù)量小,，細(xì)胞站優(yōu)勢所以不會(huì)影響到細(xì)胞的正常生長，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會(huì)影響到細(xì)胞的生長,，zui終形成惡性循環(huán),。

6-病毒

組織細(xì)胞培養(yǎng)過程中，如果沒有除去潛在的病毒,，就會(huì)產(chǎn)生病毒污染,。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒,。 盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的,。因此,，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題,。

7-非同種細(xì)胞污染

即細(xì)胞交叉污染,，由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染,。目前,，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效,。非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生,，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致,。

污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵，預(yù)防和避免污染是成功培養(yǎng)細(xì)胞的關(guān)鍵之一,。危機(jī)意識要貫徹實(shí)驗(yàn)的始終,，否則不僅浪費(fèi)時(shí)間，而且浪費(fèi)人力,、物力,，甚至造成無法彌補(bǔ)的損失。

（如何預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)的污染和清除這些污染物呢,？）慧穎 細(xì)胞庫 技術(shù)為您解答：

一,、污染的預(yù)防

預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的辦法。只有預(yù)防工作做在前,，才能將發(fā)生污染的可能性降到zui小程度,。一般預(yù)防可從以下幾方面著手：

1-從操作者做起

1操作者責(zé)任心要強(qiáng)，要細(xì)心穩(wěn)重,，操作技術(shù)要熟練,。進(jìn)無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規(guī)定穿隔離衣,。進(jìn)入后關(guān)好門,，坐下來盡量少走動(dòng)。工作開始要先用75%酒精棉球擦手,、擦瓶口和燒灼瓶口,。事先要嚴(yán)格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物,，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi),，更不能隨便使用，以免造成大批污染,。

2,、操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口,，并將瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼,。操作時(shí)盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面,。

3,、操作時(shí)要常更換吸管，切勿一根吸管做到底,。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去,。實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，zui后用消毒水浸泡的紗布擦臺面,。

2-從物品,、用品消毒滅菌著手

細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要*,，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì),，并在無菌試驗(yàn)陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌,。

3-防止細(xì)胞交叉污染

在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí),，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，做上標(biāo)記便于辨別,。并按順序進(jìn)行操作,，避免一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生混亂。

在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí),，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口,，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。

所有細(xì)胞一旦購置,，或從別處引入,，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存,，一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇,，重新培養(yǎng)。

二,、污染的清除

培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染,，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大,，宜棄之,；有細(xì)胞株留存的或可購置的，可在尋找原因后*消毒操作室,，復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞,，再培養(yǎng)。若污染細(xì)胞價(jià)值較大,，又難于重新得到,，可采取以下辦法清除。

1-使用抗生素

抗生素對殺滅細(xì)菌較有效,。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好,。預(yù)防用藥一般用雙抗生素（青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL）,，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液,。此法在污染早期可能有效,。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外,，還可用慶大霉素,、卡那霉素、多粘菌素,、四環(huán)素,、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環(huán)素處理,，每隔2～3日換液1次,，傳1～2代進(jìn)行治療。近年來有報(bào)道,，4-氟,，2-羥基喹啉（Ciprofloxacin,Cip）、截耳素衍生物（Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物（BM-2）等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效,。這三種抗生素均用PBS配成250濃縮液,，-20℃保存?zhèn)溆茫褂脻舛菴ip為10μg/mL,，BM-1為10μg/mL,，BM-2為5μg/mL。使用時(shí)先吸除污染的培養(yǎng)液,，加入含BM-1的RPMI1640培養(yǎng)液,，3天后再吸除培養(yǎng)液，加入含BM-2的RPMI1640培養(yǎng)液,，培養(yǎng)4天,，如此連續(xù)3個(gè)輪次，直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后,，再加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代3-4次,。

2-使用支原體特異性血清

用5%的兔支原體免疫血清（血凝效價(jià)1:320以上）可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長,，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性,，并且5個(gè)月后仍為陰性。但此法比較麻煩,，不如用抗生素方便,、經(jīng)濟(jì)。

3-加溫處理

將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí),，可殺死支原體,，但對細(xì)胞有不良影響。所以在處理前要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，摸索能zui大限度殺死支原體又對細(xì)胞影響zui小的加熱時(shí)間,。此法有時(shí)不可靠,。若先用藥物處理后，再以41℃加溫處理效果更佳,。

4-其他方法

除了上述去除污染的方法外,，還有動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細(xì)胞吞噬法,、污染培養(yǎng)瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過濾法等,，但均較麻煩，且效果不確定,。所以一旦支原體污染,，除非有特別重要價(jià)值，一般均棄之重新培養(yǎng),。

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