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HAC-2細(xì)胞,，人卵巢囊腺癌細(xì)胞（細(xì)胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種,，分別是細(xì)菌污染、支原體污染,、原蟲污染,、黑膠蟲污染、真菌污染,、病毒污染以及非細(xì)胞污染,，那么他們污染細(xì)胞的特點(diǎn)分別是什么呢？怎樣能夠減少污染現(xiàn)象的發(fā)生,？）

1-細(xì)菌

細(xì)菌污染常見的有大腸桿菌,，葡萄球菌等。細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn),，在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀,，培養(yǎng)液一般會在短時間內(nèi)變黃，有時靜置的培養(yǎng)液不混,，稍加震蕩會有很多混濁物漂起,。顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時在細(xì)胞表面及周圍有大量細(xì)菌存在,，細(xì)胞停止生長并有中毒表現(xiàn),。

處理：①在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的抗生素，能夠預(yù)防絕大多數(shù)的細(xì)菌污染,。

2-真菌

真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中zui常見的一種,，尤其梅雨季節(jié)快要到了，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時更易污染。污染細(xì)胞的多為煙曲霉,、黑曲霉,、毛霉菌、孢子霉,、白念珠菌,、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物,。一般肉眼可見,，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁,，倒置顯微鏡下可見于細(xì)胞之間縱橫交錯穿行的絲狀,、管狀、及樹枝狀菌絲,，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中,。

很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形,，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長,。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈,，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆,。

真菌污染后，細(xì)胞生長變慢,，但zui后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡,。真菌生長的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn),，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了,，也很難救活了。

3-支原體

支原體的大小介于細(xì)菌和病毒之間,，是一種獨(dú)立生活的微生物,。對熱敏感，對一般抗生素不敏感,。支原體的形態(tài)多變,，多吸附在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。電鏡下觀察,，中心有高密度的密集顆粒,，橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似。

因國內(nèi)的血清大多數(shù)都沒有做支原體陰性檢測,，而支原體又是牛血清中zui常見的微生物之一,。支原體污染細(xì)胞后,，培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁．但細(xì)胞變化不顯著，隨著細(xì)胞的培養(yǎng)會慢慢死亡,。

支原體污染檢測（熒光染色法）：DNA和與DNA特異性結(jié)合的熒光染料結(jié)合,，使得支原體的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察,。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn),。

解決：

1）抗生素排除法：支原體污染預(yù)防比解決好。如果不小心污染后,，可加入高濃度抗生素（常規(guī)使用的5倍濃度）作用24-48小時,，再換入常規(guī)培養(yǎng)液，但該法不保證有效,。推薦用量：慶大霉素 200μg/ml ,四環(huán)素10μg/ml ,，卡那霉素50μg/ml 。

2）加溫除菌：支原體不耐熱,，可以對支原體污染的細(xì)胞熱處理除菌,。因高溫對細(xì)胞本身也會產(chǎn)生一定影響，故熱處理前需先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),，確定對細(xì)胞影響zui小而能zui大程度的殺死支原體的時間,。

4-黑膠蟲

黑膠蟲的存在目前尚有爭議，其在低倍下為黑色點(diǎn)狀,，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的,，對細(xì)胞生長狀態(tài)不會有明顯影響,，在細(xì)胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理,。

5-原蟲

培養(yǎng)液可輕微渾濁,，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多，輕微活動,，細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢,，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚,，細(xì)胞不透亮,。他們與細(xì)胞可共生但會與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的,，但他們的數(shù)量小,，細(xì)胞站優(yōu)勢所以不會影響到細(xì)胞的正常生長，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時就會影響到細(xì)胞的生長,，zui終形成惡性循環(huán),。

6-病毒

組織細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，如果沒有除去潛在的病毒，就會產(chǎn)生病毒污染,。目前,，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。 盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng),，但生產(chǎn)疫苗是不安全的,。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗,、干擾素等生物制品制作中的難題,。

7-非同種細(xì)胞污染

即細(xì)胞交叉污染，由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開,，往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染,。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染,，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效,。非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致,。

污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵,，預(yù)防和避免污染是成功培養(yǎng)細(xì)胞的關(guān)鍵之一。危機(jī)意識要貫徹實(shí)驗(yàn)的始終,，否則不僅浪費(fèi)時間,，而且浪費(fèi)人力、物力,，甚至造成無法彌補(bǔ)的損失,。

（如何預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)的污染和清除這些污染物呢？）慧穎 細(xì)胞庫 技術(shù)為您解答：

一,、污染的預(yù)防

預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的辦法,。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到zui小程度,。一般預(yù)防可從以下幾方面著手：

1-從操作者做起

1操作者責(zé)任心要強(qiáng),，要細(xì)心穩(wěn)重，操作技術(shù)要熟練,。進(jìn)無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘,，按規(guī)定穿隔離衣。進(jìn)入后關(guān)好門,，坐下來盡量少走動,。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口,。事先要嚴(yán)格檢查器材,、溶液和培養(yǎng)物,，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi)，更不能隨便使用,，以免造成大批污染,。

2、操作者動作要輕,，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口,，并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要談話,，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面,。

3、操作時要常更換吸管,，切勿一根吸管做到底,。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢及時收拾,，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊,，zui后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

2-從物品,、用品消毒滅菌著手

細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗,、消毒要*，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì),，并在無菌試驗(yàn)陰性后才能使用,。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。

3-防止細(xì)胞交叉污染

在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時,，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分,，做上標(biāo)記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作,，避免一起進(jìn)行時易發(fā)生混亂。

在進(jìn)行換液或傳代操作時,，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口,，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。

所有細(xì)胞一旦購置,，或從別處引入,，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存,，一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇,，重新培養(yǎng)。

二,、污染的清除

培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染,，多數(shù)較難處理,。如果污染細(xì)胞價值不大，宜棄之,；有細(xì)胞株留存的或可購置的,，可在尋找原因后*消毒操作室，復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞,，再培養(yǎng),。若污染細(xì)胞價值較大，又難于重新得到,，可采取以下辦法清除,。

1-使用抗生素

抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好,。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好,。預(yù)防用藥一般用雙抗生素（青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL），污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法,，于加藥后作用24～48小時,，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期可能有效,。所用抗生素品種除青霉素,、鏈霉素外，還可用慶大霉素,、卡那霉素,、多粘菌素、四環(huán)素,、制霉菌素等,。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環(huán)素處理，每隔2～3日換液1次,，傳1～2代進(jìn)行治療,。近年來有報道，4-氟,，2-羥基喹啉（Ciprofloxacin,Cip）,、截耳素衍生物（Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物（BM-2）等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250濃縮液,，-20℃保存?zhèn)溆?，使用濃度Cip為10μg/mL，BM-1為10μg/mL,，BM-2為5μg/mL,。使用時先吸除污染的培養(yǎng)液，加入含BM-1的RPMI1640培養(yǎng)液,，3天后再吸除培養(yǎng)液,，加入含BM-2的RPMI1640培養(yǎng)液,，培養(yǎng)4天，如此連續(xù)3個輪次,，直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后,，再加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代3-4次。

2-使用支原體特異性血清

用5%的兔支原體免疫血清（血凝效價1:320以上）可去除支原體污染,，因特異抗體可抑制支原體生長,，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個月后仍為陰性,。但此法比較麻煩,，不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì),。

3-加溫處理

將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時,，可殺死支原體，但對細(xì)胞有不良影響,。所以在處理前要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn),，摸索能zui大限度殺死支原體又對細(xì)胞影響zui小的加熱時間。此法有時不可靠,。若先用藥物處理后,，再以41℃加溫處理效果更佳。

4-其他方法

除了上述去除污染的方法外,，還有動物體內(nèi)接種除菌法,、巨噬細(xì)胞吞噬法、污染培養(yǎng)瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過濾法等,，但均較麻煩,，且效果不確定。所以一旦支原體污染,，除非有特別重要價值,，一般均棄之重新培養(yǎng)。

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