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SF-268細胞，人神經(jīng)癌細胞株（細胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種,，分別是細菌污染,、支原體污染、原蟲污染,、黑膠蟲污染,、真菌污染、病毒污染以及非細胞污染,，那么他們污染細胞的特點分別是什么呢,？怎樣能夠減少污染現(xiàn)象的發(fā)生,？）

1-細菌

細菌污染常見的有大腸桿菌，葡萄球菌等,。細菌污染較易發(fā)現(xiàn),，在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，培養(yǎng)液一般會在短時間內變黃,，有時靜置的培養(yǎng)液不混,，稍加震蕩會有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮,，有時在細胞表面及周圍有大量細菌存在,，細胞停止生長并有中毒表現(xiàn)。

處理：①在培養(yǎng)液中加入相應的抗生素,，能夠預防絕大多數(shù)的細菌污染,。

2-真菌

真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中zui常見的一種，尤其梅雨季節(jié)快要到了,，進行細胞培養(yǎng)時更易污染,。污染細胞的多為煙曲霉、黑曲霉,、毛霉菌,、孢子霉、白念珠菌,、酵母菌等,。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物,。一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn),，短期內培養(yǎng)液多不混濁,，倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀、管狀,、及樹枝狀菌絲,，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。

很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠,；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形,，散在細胞周邊和細胞之間生長。鏡下看時,，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈,，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。

真菌污染后,，細胞生長變慢,，但zui后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。真菌生長的比較慢,，不象細菌那么容易被發(fā)現(xiàn),，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細胞就被污染了，也很難救活了,。

3-支原體

支原體的大小介于細菌和病毒之間,，是一種獨立生活的微生物。對熱敏感,，對一般抗生素不敏感,。支原體的形態(tài)多變，多吸附在細胞表面和細胞之間,。電鏡下觀察,，中心有高密度的密集顆粒，橫斷面與細胞微絨毛相似,。

因國內的血清大多數(shù)都沒有做支原體陰性檢測,，而支原體又是牛血清中zui常見的微生物之一。支原體污染細胞后,，培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁．但細胞變化不顯著,，隨著細胞的培養(yǎng)會慢慢死亡。

支原體污染檢測（熒光染色法）：DNA和與DNA特異性結合的熒光染料結合,，使得支原體的DNA著色,，然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點,。

解決：

1）抗生素排除法：支原體污染預防比解決好,。如果不小心污染后,，可加入高濃度抗生素（常規(guī)使用的5倍濃度）作用24-48小時，再換入常規(guī)培養(yǎng)液,，但該法不保證有效,。推薦用量：慶大霉素 200μg/ml ,四環(huán)素10μg/ml ，卡那霉素50μg/ml ,。

2）加溫除菌：支原體不耐熱,，可以對支原體污染的細胞熱處理除菌。因高溫對細胞本身也會產生一定影響,，故熱處理前需先進行預實驗,，確定對細胞影響zui小而能zui大程度的殺死支原體的時間。

4-黑膠蟲

黑膠蟲的存在目前尚有爭議,，其在低倍下為黑色點狀,，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的,，對細胞生長狀態(tài)不會有明顯影響,，在細胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理,。

5-原蟲

培養(yǎng)液可輕微渾濁,，顯微鏡下那些細小的點狀物數(shù)量非常多，輕微活動,，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細胞狀態(tài)不好,，邊緣不清楚,，細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養(yǎng),。這種共生是非常普遍的,，但他們的數(shù)量小，細胞站優(yōu)勢所以不會影響到細胞的正常生長,，只有當他們到達一定的數(shù)量時就會影響到細胞的生長,，zui終形成惡性循環(huán)。

6-病毒

組織細胞培養(yǎng)過程中,，如果沒有除去潛在的病毒,，就會產生病毒污染。目前,，從原代猴腎細胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒,。 盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng)，但生產疫苗是不安全的,。因此,，潛在病毒是細胞大量生產和疫苗,、干擾素等生物制品制作中的難題。

7-非同種細胞污染

即細胞交叉污染,，由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開,，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目前,，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染,，致使許多實驗宣告無效。非細胞培養(yǎng)物所造成的化學成分的污染也偶有發(fā)生,，大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學物質所致,。

污染是細胞培養(yǎng)的大敵，預防和避免污染是成功培養(yǎng)細胞的關鍵之一,。危機意識要貫徹實驗的始終,，否則不僅浪費時間，而且浪費人力,、物力,，甚至造成無法彌補的損失。

 （如何預防細胞培養(yǎng)的污染和清除這些污染物呢,？）慧穎 細胞庫 技術為您解答：

一,、污染的預防

預防是防止細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的辦法。只有預防工作做在前,，才能將發(fā)生污染的可能性降到zui小程度,。一般預防可從以下幾方面著手：

1-從操作者做起

1操作者責任心要強，要細心穩(wěn)重,，操作技術要熟練,。進無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規(guī)定穿隔離衣,。進入后關好門,，坐下來盡量少走動。工作開始要先用75%酒精棉球擦手,、擦瓶口和燒灼瓶口,。事先要嚴格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物,，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內,，更不能隨便使用，以免造成大批污染,。

2,、操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內打開瓶口，并將瓶口轉動燒灼,。操作時盡量不要談話,，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。

3,、操作時要常更換吸管,，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去,。實驗完畢及時收拾,，保持實驗室清潔整齊，zui后用消毒水浸泡的紗布擦臺面,。

2-從物品,、用品消毒滅菌著手

細胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要*,，各種溶液滅菌除菌要仔細,，并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌,。

3-防止細胞交叉污染

在進行多種細胞培養(yǎng)操作時,，所用器具要嚴格區(qū)分，做上標記便于辨別,。并按順序進行操作,，避免一起進行時易發(fā)生混亂。

在進行換液或傳代操作時,，注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口,，以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞。

所有細胞一旦購置,，或從別處引入,，或自己建立，均應及早留種凍存,，一旦發(fā)生污染可棄之復蘇，重新培養(yǎng),。

二,、污染的清除

培養(yǎng)細胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理,。如果污染細胞價值不大,，宜棄之；有細胞株留存的或可購置的,，可在尋找原因后*消毒操作室,，復蘇或重新購置細胞，再培養(yǎng)。若污染細胞價值較大,，又難于重新得到,，可采取以下辦法清除。

1-使用抗生素

抗生素對殺滅細菌較有效,。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好,。預防用藥比污染后再用藥效果好。預防用藥一般用雙抗生素（青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL）,，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法,，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液,。此法在污染早期可能有效,。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外,，還可用慶大霉素,、卡那霉素、多粘菌素,、四環(huán)素,、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環(huán)素處理,，每隔2～3日換液1次,，傳1～2代進行治療。近年來有報道,，4-氟,，2-羥基喹啉（Ciprofloxacin,Cip）、截耳素衍生物（Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物（BM-2）等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效,。這三種抗生素均用PBS配成250濃縮液,，-20℃保存?zhèn)溆茫褂脻舛菴ip為10μg/mL,，BM-1為10μg/mL,，BM-2為5μg/mL。使用時先吸除污染的培養(yǎng)液,，加入含BM-1的RPMI1640培養(yǎng)液,，3天后再吸除培養(yǎng)液，加入含BM-2的RPMI1640培養(yǎng)液,，培養(yǎng)4天,，如此連續(xù)3個輪次，直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后,，再加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代3-4次,。

2-使用支原體特異性血清

用5%的兔支原體免疫血清（血凝效價1:320以上）可去除支原體污染,，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉為陰性,，并且5個月后仍為陰性,。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便,、經(jīng)濟,。

3-加溫處理

將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時，可殺死支原體,，但對細胞有不良影響,。所以在處理前要進行預試驗，摸索能zui大限度殺死支原體又對細胞影響zui小的加熱時間,。此法有時不可靠,。若先用藥物處理后，再以41℃加溫處理效果更佳,。

4-其他方法

除了上述去除污染的方法外,，還有動物體內接種除菌法、巨噬細胞吞噬法,、污染培養(yǎng)瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過濾法等,，但均較麻煩，且效果不確定,。所以一旦支原體污染,，除非有特別重要價值，一般均棄之重新培養(yǎng),。

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