染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation,，簡稱ChIP）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)。它利用抗原抗體的特異性反應(yīng),，可以真實(shí)地反映體內(nèi)蛋白分子與基因組DNA結(jié)合的狀況,。下面我們就zui基本的實(shí)驗(yàn)步驟，實(shí)驗(yàn)中的小技巧以及需要注意的問題簡單介紹一下,。

1.  細(xì)胞固定

    甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì),，蛋白質(zhì)-DNA,，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復(fù)合體,，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布,。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到1個(gè)小時(shí),。需注意的是,，交聯(lián)時(shí)間如果過長，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎,，影響ChIP結(jié)果,，而且實(shí)驗(yàn)材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過短,，則交聯(lián)不*,，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止,。

2.  染色質(zhì)片段化

    交聯(lián)后的染色質(zhì)需被超聲波切成400~600bp的片段,，以便目的蛋白的暴露，利于抗體識(shí)別,，其片段破碎的均勻一致性對(duì)結(jié)果影響至關(guān)重要,。傳統(tǒng)的超聲波破碎是利用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫,，這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性,，進(jìn)而影響ChIP的效率。而來自比利時(shí)的Bioruptor非接觸式超聲波破碎儀采用溫和的破碎方式,，保證了蛋白的活性,，DNA破碎效果均一，同時(shí)外接水循環(huán)儀保證了實(shí)驗(yàn)的溫度穩(wěn)定性,，成為目前ChIP實(shí)驗(yàn)的,。

3.  染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)

Input對(duì)照：

在進(jìn)行免疫沉淀前，需要取一部分?jǐn)嗔押蟮娜旧|(zhì)做Input對(duì)照,。Input需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過逆轉(zhuǎn)交聯(lián),，DNA純化，以及zui后的檢測,。Input對(duì)照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量,，按照取樣比例換算出ChIP的效率,，所以Input對(duì)照是ChIP實(shí)驗(yàn)*的步驟。

Beads選擇：

接下來,，利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-抗體特異反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物,，然后使用Agarose beads或Magnabeads沉淀此復(fù)合物,，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過多次洗滌,，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后,，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合物。

抗體選擇：

染色質(zhì)免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵,。因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時(shí),，抗體的抗原表位可能因?yàn)榕c結(jié)合位點(diǎn)的距離太近，不能被抗體識(shí)別,，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復(fù)合物,，直接影響ChIP的結(jié)果。

陰性對(duì)照設(shè)置：

在做ChIP實(shí)驗(yàn)時(shí),，需設(shè)置對(duì)照,，以便于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性進(jìn)行評(píng)估。陽性抗體和陰性抗體對(duì)照是zui基本的實(shí)驗(yàn)對(duì)照,。陽性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的比較保守的蛋白的抗體,，常用的包括組蛋白抗體或RNAPolymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清,。目的蛋白抗體的結(jié)果與陽性抗體和陰性抗體的結(jié)果相比較,，才能得出正確結(jié)論。另外,，還應(yīng)考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結(jié)合的可能,，所以通常還會(huì)選擇一對(duì)陰性引物，即目的蛋白肯定不會(huì)結(jié)合的DNA序列,，作為該抗體的陰性對(duì)照,。*的陰性對(duì)照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結(jié)合的序列。如果目的蛋白沒有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的抗體,，只有其他用途的抗體時(shí),，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白,，再進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的檢測,。

4.  交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化

用不含DNase的RNase和Proteinase K，65℃保溫6小時(shí)逆轉(zhuǎn)交聯(lián),，經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提,、乙醇沉淀純化DNA。在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)時(shí)不使用Proteinase K,，然后用丙酮回收有機(jī)相中的蛋白質(zhì),，進(jìn)行分析。

5.  DNA的鑒定

zui常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR,。由于啟動(dòng)子區(qū)域序列多樣性的特點(diǎn),，所以不同的細(xì)胞系或不同的動(dòng)物品系的同一基因的啟動(dòng)子序列有可能不同,，因此可設(shè)計(jì)多對(duì)引物來反復(fù)驗(yàn)證ChIP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果.

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以下為購買細(xì)胞系后的售后小知識(shí)：

1、CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔,？

定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之,。

2、為何培養(yǎng)基保存于4 ℃ 冰箱中,， 顏色會(huì)偏暗紅色,， 且pH值會(huì)越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4 ℃ 冰箱中,， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑（通常為phenol red） 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅,。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果,， 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí),， 可以通入無菌過濾之CO2,， 以調(diào)整pH 值。

3,、各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish,，flask是否均相同？

不同廠牌的dish 或flask,， 其所coating 的polymer 不同,， 制造程序亦不同， 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大之影響,， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異,。

4、購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形,？ 購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳,， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳,。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤,。冷凍細(xì)胞解凍后,， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞,。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤,。細(xì)胞置于–80℃太久。

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