人卵巢癌細胞系 活化與復(fù)蘇

1. 收到人卵巢癌細胞系包裹時,， 請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形,， 若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養(yǎng),， 或立即冷凍保存(置于–70 °C,， 隔夜后,， 移到liq N2)。

人卵巢癌細胞系細胞復(fù)蘇的原則－快速融化：

必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃,，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化,，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害,。

具體操作

一. 實驗前準備：

1.將水浴鍋預(yù)熱至37℃

2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面,。

3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管,、培養(yǎng)瓶等等,。

二．取出凍存管：

1.根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。

2.從液氮罐中取出細胞盒,，取出所需的細胞,，同時核對管外的編號。

三．迅速解凍：

1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍,，并要不斷的搖動,，使管中的液體迅速融化。

2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體*溶解,，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁,，再拿入超凈臺內(nèi)。

四.平衡離心：用架盤天平平衡后,，放入離心機中3000r/min 離心3min

五.制備細胞懸液：

1.吸棄上清液,。

2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液,。

六.細胞計數(shù)：細胞濃度以5×105/ml為宜,。

七.培養(yǎng)細胞將復(fù)合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng),，換液的時間由細胞情況而定,。

初學者易犯錯誤：

1.水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃。

2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多,，導致傳熱不佳,，使融化時間延長。

3.離心前忘記平衡,，導致離心機損壞和細胞丟失,。

4.一次復(fù)蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管,，導致細胞交叉污染,。

（另：冷凍細胞解凍程序）

2.1. 依據(jù)人卵巢癌細胞系數(shù)據(jù)單之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它之成份和比例， 制備培養(yǎng)基,。絕大多數(shù)之細胞均無法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類,， 若因?qū)嶒炐枰?必須有所不同時， 務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成,， 確定細胞適應(yīng)后,， 方進行所需之實驗。

2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清),，對細胞而言差異極大,，請務(wù)必依據(jù)細胞株資料單之血清種類培養(yǎng)之。

2.3. 將培養(yǎng)基置于 37 °C水槽中回溫,，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之,， 移入無菌操作臺內(nèi)。取出冷凍管,， 立即放入37 °C 水槽中快速解凍,， 水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿， 否則易發(fā)生污染,。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化后,， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內(nèi),。

2.4. 依據(jù)細胞種類和濃度,，于無菌操作臺內(nèi)取 10 ml培養(yǎng)基加至 T25或 T75 flask中。取出已解凍之細胞懸浮液,，緩緩加入T25 或T75 flask 內(nèi)之培養(yǎng)基,， 混 合均勻，放入37 °C,，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng),。

2.5. 對絕大多數(shù)細胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑DMSO,，不會對細胞之貼附或活化有不良影響,，不需立刻由解凍細胞中去除，待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可,。唯對極少數(shù)因?qū)MSO 敏感或會造成細胞分化之細胞,，需立即去除DMSO 者， 則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中,離心300 xg (約1000 rpm),，5 分鐘,，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基,，將細胞均勻混合后， 轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中， 再放入37 °C,， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng),。收到T25 flask 細胞時， 處理方式為︰

1. 于寄送過程中,，為避免起泡造成細胞脫落死亡,，T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。請檢查flask 外觀,，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象,，若有任何問題， 不要打開蓋子,，請立即通知細胞實驗室,。

2. 將原封之T25 flask 靜置于37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱中,，使細胞回溫至37 °C,， 并讓運送過程中少數(shù)脫落的細胞可再附著生長。隔天后,，于無菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基,，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內(nèi),，依 一般培養(yǎng)方式再將細胞置入培養(yǎng)箱中或細胞已長滿盤,， 則將細胞做傳代培養(yǎng)。

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