細胞培養(yǎng)常見問題及其解決

1,、如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件,。在MEM中培養(yǎng)的細胞,，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長?？傊?，MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始,。

2,、何時須更換培養(yǎng)基？

視細胞生長密度而定,， 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間,，按時更換培養(yǎng)基即可,。

3、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,？

不能,。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,， 細胞大都無法立即適應,， 造成細胞無法存活。

4,、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類,？

不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源,，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響,。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活,。

5、何謂FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,， 兩者都是指胎牛血清,， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用,。CS (calf serum) 則是指小牛血清,。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6,、培養(yǎng)細胞時應使用5 % 或10% CO2,？或根本沒有影響？

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng),， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2 濃度,。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養(yǎng)時應使用10 % CO2,；當培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時,， 則應使用5 % CO2 培養(yǎng)細胞。

7,、Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么,？Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別,？

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值,。Eagles液在空氣水平的CO2 中,，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸,。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,，需要用Eagles液，,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織,，用Hanks液就可以了。

8,、細胞之接種密度為何,？

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因,。

9,、懸浮性細胞應如何繼代處理？

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中,， 稀釋細胞濃度即可,， 若培養(yǎng)液太多時， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高,， 直到無法容納為止,。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度,， 重復前述步驟即可,。

10、冷凍管應如何解凍,？

取出冷凍管后,， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化,， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂,。

11,、細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應馬上去除DMSO,？

除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外,， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中,， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可,， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

12,、附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度,？應如何處理？

一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na,。*次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,， 保存于–20 °C，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,， 并可減少污染之機

13,、欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速,？

欲回收動物細胞,， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘,， 過高之轉速,， 將造成細胞死亡。

14,、細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何,？

動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能,， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中,， 必須使用前先行配制完成。

15,、DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何,？

冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),， 其本身即為無菌狀況,， *次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C,， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質,， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO,， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜,。

16、冷凍保存細胞之方法,？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存,。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下,， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時,， 以防止冰晶過大,，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,，惟存活率稍微 降低一些,。

17、細胞欲冷凍保存時,， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度,？

冷凍管內細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜,。

18,、培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統(tǒng)中外,， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,， 培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。

19,、應如何避免細胞污染,？

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌,、霉菌,、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當,、操作室環(huán)境不佳,、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術,、清潔的環(huán)境,、與品質良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。

20,、如果細胞發(fā)生微生物污染時,，應如何處理？

原則上：直接滅菌后丟棄之,。

當重要的培養(yǎng)污染時,，研究者可能試圖消除或控制污染。首先,，確定污染物是細菌,、真菌、支原體或酵母,，把污染細胞與其它細胞系隔離開,，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器,。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平,。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要,。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

（1）無抗生素的培養(yǎng)基中消化,、計數(shù)和稀釋細胞,，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。

（2）分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,，或幾個小培養(yǎng)瓶中,。在一個濃度梯度范圍內,，把選擇抗生素加入到每一個孔中,。例如,，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25,，0.50,，1.0,，2.0,，4.0,8.0 mg/ml。

（3）每天觀測細胞毒性指標,，如脫落,，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓,。

（4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2～3代,。

（5）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代,。

（6）重復步驟4,。

（7）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代,，確定污染是否以已被消除。

21、支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀,？

不能,。除極有經驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株,， 無法以其外觀分辨之,。

22,、支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響,？

支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前,，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數(shù)據(jù)方有意義。

23,、偵測出細胞株有支原體污染時,， 該如何處理,？

直接滅菌后丟棄,，以避免污染其它細胞株。

24,、CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔,？

定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

25,、為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中,， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中,， 培養(yǎng)基內之CO2 會逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅,。培養(yǎng)基偏堿之結果,， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時,， 可以通入無菌過濾之CO2,， 以調整pH 值。

26,、各種細胞培養(yǎng)用的dish,，flask是否均相同？

不同廠牌的dish 或flask,， 其所coating 的polymer 不同,， 制造程序亦不同,， 雖對大部分細胞沒有太大之影響， 惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異,。

27,、購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形,？

研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少,， 大都是因為離心過程操作上的失誤,， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失,。建議細胞解凍后不要立刻離心， 應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可,。

28,、購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳,， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳,。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后,，加以洗滌細胞和離心,。懸浮細胞誤認為死細胞,。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C 太久,。

29,、L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎,？

L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的,。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源,、參與蛋白質的合成和核酸代謝,。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有zui終定論,。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,，而氨對于一些細胞具有毒性。

30,、GlutaMAX-I是什么,？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定,？

GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,，釋放L-谷氨酰胺供利用,。

GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解,，如果在相同條件下,，L-谷氨酰胺幾乎*降解。

31,、什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅,？

酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色,，堿性時為紫色,。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用,，（特別是雌激素）,。為避免固醇類反應，培養(yǎng)細胞,，尤其是哺乳類細胞時,，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,，一些研究人員在做流式細胞檢測時,，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

32,、如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞,？

用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到200～2000個/毫升，在0.1毫升細胞懸液中加0.1毫升0.4％的臺盼蘭溶液,。輕輕混勻,，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞,。活細胞排斥臺盼蘭,，因而染成藍色細胞是死細胞,。

33、培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么,？

丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源,，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是,，如果沒有葡萄糖的話,，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

34,、二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎,？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么,？

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性,。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,，用EDTA清洗細胞,，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子,。

35、室溫下配制的Tris-HCl溶液,，在37℃使用時PH值是多少,？

緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,，25℃,，37℃時，不同PH值,。

50mM Tris-HC 溶液在4℃,，25℃，37℃時,，不同PH值

4°C  25°C   37°C

8.1      8.5     7.2

8.2      7.6     7.3

8.3      7.7     7.4

8.4      7.8     7.5

8.5      7.9     7.6

8.6      8.0     7.7

8.7      8.1     7.8

8.8      8.2     7.9

8.9      8.3     8.0

9.0      8.4     8.1

9.1      8.5     8.2

9.2      8.6     8.3

9.3      8.7     8.4

9.4      8.8   8.5

36,、如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎,？

我們推薦使用脫落細胞的方法,，此技術破壞性zui小，生活力zui高,。通過使用巴斯德吸液管,，讓細胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶,。只有在必要的情況下,，才使用胰酶消化細胞。

37,、胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞：

（1）去除培養(yǎng)基,。

（2）用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS,。

（3）加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）,。

（4）37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動,。

（5）向細胞中加入2ml 細胞培養(yǎng)液,，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁,，移入同一錐形管中,。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性,。）

（6）離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養(yǎng)基,。

（7）用新的培養(yǎng)基重新懸浮細胞,。傳代。

38,、在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養(yǎng)時,，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養(yǎng)細胞聚集的形成,，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液,。

39、在重新凍存sf9細胞前,，它可以傳多少代,？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎,？

通常情況當細胞經過30次傳代后,，應該返回凍存。無論什么時候計數(shù)時,，都應該檢查細胞活力,。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用,。如果活力和加倍時間下降,，它們的感染力將不在是有效的。

40,、貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基,，在放置幾天后顏色變紫?

這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導致了pH值的上升,。您可以在使用前松開瓶口,，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）,。

41,、細胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用,？

如果細胞培養(yǎng)基偶然被凍,，您應該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產生,。如果沒有沉淀產生,，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀,，只能丟棄這些培養(yǎng)基,。

42,、無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？

當在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時,，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%,。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下,，抗生素不被滅活,，可能對于細胞達到毒性水平。

43,、培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后,，可長期保存嗎？

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時,，您應該在兩到三周內使用它,。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

44,、培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎,？

大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,，將會影響它的性能,。

45、為什么要在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?

胰蛋白酶在4℃就可能開始降解,，如果在室溫下放置超過30分鐘,，就會變得不穩(wěn)定。

46,、保存血清的方法?

我們建議血清應保存在-5℃至-2O℃,。若存放于4℃時，請勿超過一個月,。若一次無法用完一瓶,，建議無菌分裝血清至恰當?shù)臏缇萜鲀龋俜呕乩鋬觥?/span>

47,、如何解凍血清才不會使產品質量受損?

將血清從冷凍箱取出后,，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融,。但必須注意的是,，融解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。

48,、血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn),，該如何處理?

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后,，也會存在于血清中,，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物,，并不影響血清本身的質量,。

若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內,，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內一起過濾,。不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞過濾膜,。

49,、為什么要熱滅活血清?

加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件,，刺激平滑肌收縮,，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞,。在免疫學研究,，培養(yǎng)ES細胞、平滑肌細胞時,，推薦使用熱滅活血清,。

50、有必要做熱滅活嗎?

實驗顯示,，經過正確處理的熱滅活血清,，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進,，或*沒有任何作用,，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低,。而經過熱處理的血清,，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,，像是“小黑點",，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中,，又會使此沉淀物更增多,，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。

若非必須,，可以不需要做熱處理這一步,。不但節(jié)省時間，更確保血清的質量!

51、為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀?

有些胎牛血清產品沒有預老化,，儲存在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素,、纖維蛋白原,、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量,。推薦在－20℃儲存胎牛血清,，避免反復凍融。

52,、如何避免沉淀物的產生?

我們建議您在使用血清的時候,，注意下列的操作:

(1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫),，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃),，非常容易產生沉淀物。

(2)解凍血清時,，請隨時將之搖晃均勻,，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生,。

(3)請勿將血清置于37℃太久,。若在37℃放置太久，血清會變得混濁,，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害,，而影響血清的質量。

(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,，若非必要,，可以無須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活,，請遵守56℃,，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻,。溫度過高,，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多,。