人程序性死亡分子-1(PD-1)ELISA試劑盒說明書

檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預先包被人程序性死亡分子-1（PD-1）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本,、標準品、HRP標記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人程序性死亡分子-1（PD-1）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，計算樣品濃度。

樣品收集,、處理及保存方法

1. 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激,，收集血液后,，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2. 血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清,。

3. 細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉離心10分鐘取上清。

5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測,，請按一次用量分裝,，凍存于-20℃，避免反復凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

自備物品

1.     酶標儀（450nm）

2.     高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL

3.     37℃恒溫箱

操作注意事項

1. 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘,。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結晶*溶解后再使用,。

2. 實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存,。

3. 預處理后的樣本無需稀釋,，直接取10μL加樣即可。

4. 嚴格按照說明書中標明的時間,、加液量及順序進行溫育操作,。

5. 所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

注：標準品用標準品稀釋液依次稀釋為：240、120,、60,、30、15,、7.5 pg/mL.

試劑的準備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。

洗板方法

1. 手工洗板：甩盡孔內液體,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min后甩盡孔內液體,，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次,。

2. 自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min,，洗板5次。

操作步驟

1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設置標準品孔,、樣本孔和空白孔,，空白孔什么都不加；標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,；

3. 待測樣本孔先加待測樣本10μL,，再加樣本稀釋液40μL；

4. 隨后標準品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL,，,，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

5. 棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）,。

6. 所有孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。

7. 所有孔加入終止液50μL，15min內,，在450nm波長處測定各孔的OD值,。

結果判斷

 繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標,，對應OD值作縱坐標,，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值,。

試劑盒性能

1.  準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值，大于等于0.9900,。

2.  靈敏度：zui低檢測濃度小于1.0 pg/mL,。

3.  特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

4.  重復性：板內,、板間變異系數(shù)均小于15%。

5.  貯藏：2-8℃,，避光防潮保存,。

6.  有效期：6個月