elisa細(xì)胞裂解液獲取方法

細(xì)胞裂解是改變細(xì)胞通透性和活性的重要實(shí)驗(yàn)方法。通常我們都會(huì)想到用RIPA裂解液提取的蛋白做elisa,，但是這個(gè)方法不太推薦,，從提取蛋白自身的角度來(lái)考慮，RIPA裂解液可以使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)破壞,，即破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu),，從而使抗原決定簇得以充分暴露在外，更有利于被檢測(cè)出來(lái)；而從試劑盒本身的角度來(lái)考慮,，以雙抗體夾心法為例,，提取的蛋白中含有RIPA裂解液，當(dāng)加入到包被的孔板當(dāng)中時(shí),，可能同樣會(huì)對(duì)孔板中的包被的抗體起到了裂解作用（如SDS）,，從而使其失去該有的特異性，這方面可能需要考慮在內(nèi)的,。

下面我們推薦另外2種比較好的獲取細(xì)胞裂解液中蛋白的方法：

1,、         凍溶法，是一種常用的機(jī)械裂解方式比,，通常由冷凍和解凍兩部分組成（freezing and thawing）,，。原理：由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹,，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎,。冷凍通常在液氮或-20°C冰上進(jìn)行，解凍可以在37,、50,、65 或100℃水浴中進(jìn)熱休克比化學(xué)裂解溫和，但是很有效,，有資料表明用熱休克和溶菌酶與SDS的方法獲得了90%的細(xì)胞裂解率,。如果需求的蛋白表達(dá)很低，我們可以用細(xì)胞裂解液作輔助,，方法是先用裂解液室溫裂解一小時(shí),，然后反復(fù)凍溶三次。一般可以裂解到8ug/ul,。切記裂解細(xì)胞時(shí)不要加太多裂解液,，而且避免過(guò)多的反復(fù)凍溶。

2,、         超聲波處理（Ultrasonication）既利用超聲加熱的方法,，把細(xì)胞破碎。但這種處理會(huì)導(dǎo)致DNA 的斷裂,，所以加熱不宜過(guò)劇烈,，要設(shè)定好超聲時(shí)間和間隙時(shí)間，一般超聲時(shí)間不超過(guò)5秒,，間隙時(shí)間大于超聲時(shí)間,，這些都有利于保護(hù)酶的活性,。bead-beating 也是常用的機(jī)械處理方式,，有報(bào)道指出bead-beating 比熱休克和化學(xué)裂解的細(xì)胞裂解效果更好 雖然DNA產(chǎn)量較高，但通常得到的dna片段較小。

3,、         Western Blot方法,，方法步驟主要以下：

1）一瓶細(xì)胞（100ml的瓶子），PBS洗2次,，胰酶消化,，加入10ml 培養(yǎng)液，制備成細(xì)胞懸液,；

2）細(xì)胞懸液移入10ml離心管中,，4。C,，2500rpm,，離心5min；

3）上清,，加入預(yù)冷的PBS（即4,。C存放的PBS）于離心管中，吹打,，4,。C，2500rpm,，離心5min,；棄上清，重復(fù)上述步驟一次,；共洗細(xì)胞2次,，充分洗掉培養(yǎng)液；

4）上清,，加入200ul細(xì)胞裂解液（每1ml裂解液中加入10ulPMSF）,，置于冰上，裂解40min～1h,；裂解過(guò)程中可用槍頭吹打或間斷搖動(dòng)離心管,，以使蛋白充分裂解；

5）出離心管,，于4,。C，12000rpm,，離心5min,；

6）上清移入EP管中，-20,。C保存,，即可。

細(xì)胞裂解機(jī)制被廣泛應(yīng)用于各類的生物實(shí)驗(yàn)中。為達(dá)到*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，需要注意的是所有的實(shí)驗(yàn)步驟都需在四度以下進(jìn)行,，并且避免過(guò)多的反復(fù)凍融。而且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記得戴手套,。

綜述來(lái)源：慧穎生物免疫實(shí)驗(yàn)室

：王

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