您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
11
常用的半抗原與蛋白偶聯(lián)方法簡介
常用的半抗原與蛋白偶聯(lián)方法簡介
———文章轉(zhuǎn)自zjubell,， 發(fā)表在丁香園免疫學(xué)技術(shù)論壇。
（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶聯(lián)
1,、混合酸酐法,，也稱氯甲酸異丁酯法（isobutyl chloroformate method）
偶聯(lián)時，半抗原分子中的羧基可與氯甲酸異丁酯在有機(jī)溶劑中形成混合酸酐（mixed acid anhydride）,然后與蛋白分子中的氨基形成肽鍵,。
氨甲喋呤（MIT）與β-半乳糖苷酶偶聯(lián)的混合酐法
1,、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷卻至10度,，加2ul氯甲酸異丁酯,，10度攪拌反應(yīng)30分鐘。
2,、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解,。
3,、10度反應(yīng)4小時（必要時加NaOH,以維持溶液的pH為9.0,，q然后4度過夜。
4,、過sephadex G-25層析柱,，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L,、2-Hydroxy-1-ethanethiol 10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸緩沖液（pH7.5）平衡和洗脫,，合并含酶的洗脫管內(nèi)液體,，進(jìn)一步純化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）,、NaN3 0.02%（w/v）的緩沖液中,。
2、碳化二亞胺法制備3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血藍(lán)蛋白免疫原的操作步驟
1,、 取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液）
2,、 取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解（II液）
3,、 取血藍(lán)蛋白（lemocyanin） 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液）
4,、 將II液與III液混合，在磁力攪拌下逐滴加入I液（余下0.5ml）
5,、 室溫下避光攪拌1小時,，逐滴加入余下的I液
6、 4度攪拌12小時
7,、 靜置10小時（4度）
8,、 有蒸餾水使之充分透析（約48小時），得免疫原,。
3,、孕酮與與β-半乳糖苷酶偶聯(lián)的N-羥琥珀酰亞胺酯法
1、 用二堊烷（dioxane）溶解孕酮-11-半琥珀酸酯,，配成濃度為100m mol/L的溶液,。
2、 加羥琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide） 100 m mol/L 和 DCC（二環(huán)已基碳化二亞胺）,，200 m mol/L, 4度反應(yīng)16小時,。
3、 用簿層掃描方法純化（氯仿：水=9：1）
4,、 按孕酮/酶摩爾濃度比約為10的比例,，將上述溶液加入到酶液（用pH7.4，濃度50 m mol/L的磷酸緩沖液溶解）中,。
5,、
（二）含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯(lián)
1、芳香胺類半抗原與蛋白質(zhì)重氮化偶聯(lián)的操作步驟
1,、 用0.1 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L濃度的半抗原,。
2、 滴加1％NaNO2（過量）,，4度持續(xù)攪拌,。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物試紙或在白色磁磚上加1％淀粉和50m mol/L KI進(jìn)行監(jiān)控。游離HNO2可將氧化物氧化成碘,，碘再與淀粉反應(yīng)變成藍(lán)黑色,。
3,、 溶液變成藍(lán)黑色后，繼續(xù)反應(yīng)15分鐘,。
4,、 用pH9.0、濃度為200m mol/L的硼酸或碳酸緩沖液溶解蛋白,。
5,、 邊攪拌，邊加入重氮化的半抗原（防止局部發(fā)生酸過量現(xiàn)象）,，調(diào)節(jié)pH到9.5,。
6、 冰箱中攪拌反應(yīng)2小時,，不斷調(diào)節(jié)pH到9.0,。
7、 用PBS透析2天
8,、 -20度保存（濃度為20mg/mL）
雙功能的酰亞胺酯（imidate esters）可以氨基反應(yīng),，形成脒。例如：用二甲基已二酰亞胺酯（dimethyladipimide）將去甲基三正喋呤（desmethylmortriptyline）與β-半乳糖苷酶偶聯(lián),。
2,、、應(yīng)用雙功能酰亞胺酯（imidate esters）制備去甲基三正喋呤-與β-半乳糖苷酶標(biāo)記特的操作步驟
1,、 用含5％（W/V）N-乙基嗎啉的無水甲醇0.4ml,在室溫下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亞胺酯（dimethyladipimide）（A液）
2,、 取與β-半乳糖苷酶 100 ug, 溶于pH9.9的100 m mol/L碳酸緩沖液（含MgCl2 10m mol/L,2-Hydroxy-1-ethanethiol 10 m mol/L 0.1ml（B液）
3、 將A液倒入B液,。
4,、 20度反應(yīng)90分鐘后，加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-Hydroxy-1-ethanethiol 10 m mol/L,、pH7.5的Tris-醋酸緩沖液（50m mol/L） 1ml, 終止反應(yīng),。
5、 過sephadex G-25, 去除小分子物質(zhì),，得酶標(biāo)記物（約75％的酶與半抗原結(jié)合,，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤（demethylmortriptyline ）進(jìn)行偶聯(lián)，則只有15％的酶與之結(jié)合,。
（三）含巰基半抗原的偶聯(lián)
可用馬來酰亞胺方法與蛋白偶聯(lián),。此外，將載體蛋白用溴乙酰胺（bromoacetamide）激活,?；?qū)⑤d體蛋白與半抗原在pH4.0的醋酸緩沖液中，通過過氧化氫的作用形成二硫鍵,，也可以將半抗原連接到蛋白質(zhì)分子上,。
（四）含羥基的半抗原偶聯(lián)
醇類羥基通過形成半琥珀酸酯轉(zhuǎn)化為羧基的操作步驟
1、 15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g 琥珀酸酐（succinic anhydride）和8.7ml 三乙基胺（triethylamime）用100 ml乙酰乙酯溶解,。
2,、 加熱回流1小時。
3,、 減壓蒸餾去溶劑,，,殘余物用5% NaHCO3水溶液溶解。
4,、 用Ether洗滌兩次,，然后用H2SO4進(jìn)行s酸化（pH到2.0）.
5、 用水洗滌固形物（為三氯乙基半琥珀酸酯）兩次,，用氯仿-已烷使其結(jié)晶（產(chǎn)量約75％,，熔點(diǎn)88-89度）
6、 取2.5g 半琥珀酸酯溶于6.5ml 亞硫酰氯（thionyl chloride）中,，65度加熱30分鐘,。
7、 減壓蒸發(fā),，干燥1小時（高度真空條件下）,。
8、 將上述產(chǎn)生（2,，2,，2-三氯憶基琥珀酰氯）溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺（N,N-dimethylethylacetamide）中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時,。
9,、 65度真空蒸發(fā)后，用異丙醇使結(jié)晶析出來（得鹽酸化的結(jié)晶---5`-酯約84％,，熔點(diǎn)160度）,。
10、用溶于二甲基甲酰胺中的鋅和醋酸解離三氯乙酯,，得f半抗原-半琥珀酸酯,，這樣引和的羧基可與蛋白質(zhì)偶聯(lián)（如用碳化二亞胺化）。
半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的操作步驟
1,、 20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中,，4度避光反應(yīng)30分鐘。
2,、 加1滴乙二醇（得A液）
3,、 將A液加入到β-半乳糖苷酶液（20mg/ml,用150m mol/L NaCl,10m mol/L MgCl2水溶液溶解，用3％K2CO3調(diào)節(jié)pH至9.0）中
4,、 4度反應(yīng)2小時,，期間不斷調(diào)節(jié)pH9.0
5,、 加入臨時配制的50 mg/ml NaBO4溶液，用量為反應(yīng)體積的1/10,。 4度反應(yīng)過夜,。
6、 用含有MgCl2 10m mol/L,2-Hydroxy-1-ethanethiol 10 m mol/L,、 NaCl 100 m mol/L的50 m mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）透析（更換透析液數(shù)次）
（五）含酮基或酮基半抗原的偶聯(lián)
是將酮基經(jīng)羥胺類化合物處理變成肟類化合物,，再進(jìn)一步將肟類化合物中的羥基，衍變成羧基化合物,，再進(jìn)一步進(jìn)行含羧基半抗原的偶聯(lián)操作,。這類羥胺類化合物主要有：氨氧乙酸aminoxy acetic acid 或羧甲氧胺carboxymethoxyl amine 或者鹽酸羥胺
酮基的類固醇分子中引入羧基的操作步驟
1、 在200ml 乙醇中,，加入O-（羧甲基）羥胺 （O-（carboxyl）hydroxylamine）和酮基半抗原,，使其濃度分別為10m mol/L 和4m mol/L
2、 加熱回流90分鐘
3,、 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),，減少容積，然后加水至40ml,，用ether抽提
4,、 用水洗滌ether抽提物，用Na2SO4干燥成白色粉末,。
（六）,、其他半抗原的偶聯(lián)
雖含有游離基團(tuán)，但因這些基團(tuán)對于維其生物活性十分重要,，因些不能直接用來與載體蛋白 偶聯(lián),。
制備雌二醇-6-肟的操作步驟
a、 雌二醇二醋酸鹽的制備
1,、 1g雌二醇溶于14ml 吡啶及3.5ml 醋酐中
2,、 加熱回流1小時，冷卻后傾入冰水中,。
3,、 收集白色晶體，得產(chǎn)物約1.1g（熔點(diǎn)126到127度）
b,、 雌二醇-6-酮-二醋酸鹽的制備
4,、雌二醇二醋酸鹽1.1g，滴加冰醋酸3.8ml 溶解后加含0.93g CrO3的含水冰醋酸6.35ml （H2O:Hac=0.75:5.6）
5,、室溫?cái)嚢?小時,，靜置24小時
6、用水稀釋，用ether提取4次
7,、用蒸餾水洗2次
8,、減壓蒸餾，得結(jié)晶油狀渣物,。
9,、用90度烘干20分鐘,，得粗制品約500mg
10,、用11ml 無水乙醇溶解粗制品，再加1.1ml 冰醋酸及1.5g吉納你特T試劑（Girad T）,，回流1小時,。
11、冷卻后,，用冰致冷的蒸餾水稀釋,，用2.5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至6.0-6.2.
12、用ether抽提3次,，棄去ether,。
13、水層用濃鹽酸酸化（鹽酸終濃度為1mol/L）.
14,、室溫靜置2小時,。
15、用ether抽提3次,。
16,、合并ether抽提液，用0.125mol/L碳酸鈉溶液洗1次,，用蒸餾水洗3次,。
17、用無水硫酸鈉脫水,，蒸干,。
18、加7ml 醋酐,，回流20分鐘,。
19、冷卻后傾入用冰致冷的蒸餾水中,，然后過濾,、干燥得產(chǎn)物約176mg （熔點(diǎn)為162-166度）
c、 二醇-6-酮的制備
20,、用5.5ml 20％的氫氧化鉀-甲醇溶液（W/V）溶解雌二醇-6-酮-二醋酸鹽（176mg）,在室溫下于氮?dú)庵兴?4小時,。
21、加蒸餾水稀釋，用ether抽提3次,。
22,、在ether提取液中無水硫酸鈉進(jìn)行脫水，蒸發(fā)干燥,，得產(chǎn)物約60mg（熔點(diǎn)為278-282度）
d,、 雌二醇-6-肟的制備
23、取雌二醇-6-酮 50mg ,鹽酸羧甲基羧胺50mg,溶于20％含水甲醇（V/V）7ml 和1mol/L醋酸鈉4ml中,，回流1.5小時。
24,、減壓,、蒸餾、濃縮后,，加蒸餾水20ml
25,、用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5。
26,、用醋酸乙酯抽提4次
27,、水層用1 mol/L鹽酸酸化至pH2.5。
28,、用醋酸乙酯抽提4次
29,、合并抽提液，蒸干,，得產(chǎn)物約100mg（結(jié)晶熔點(diǎn)約186-188度）
其他半抗原如：青霉素,、生物素、地高辛,、熒光素等半抗原交聯(lián),。