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器材和試劑]
● PCR試劑和設(shè)備
● 1ug任何舍有scFv及（GIy4Ser）3接頭的載體
● RHuJH引物,、RHuVκ引物和RHuVλ引物,，10pmol/ul
[方法]
1．在0．5ml微量離心管內(nèi)配制用于擴增的主混合液,。所顯示的主混合液用于VH—Vκ接頭,。對于VH—Vλ接頭的主混合液,，n＝29,。
單個反應(yīng)主混合液/ul （n＝25）
● 水 37 925
● 10×Vent緩沖液 5．0 125
● 20×dNTPs 2．5 62．5
● Vent DNA聚合酶 0．5 12．5
2．取24支0．5ml試管，每管分別加入RHuJH引物和RHuVκ引物,，各2ul,。RHuJH引物和RHuVκ引物共有24種可能的結(jié)合形式。而對于VH—Vλ接頭,，則用RHuVl引物替代RHuVκ引物即可,，共可編為28管,。如無加熱蓋，可以加入l滴輕質(zhì)礦物油覆蓋反應(yīng)液,。
3．設(shè)1個陰性對照管,，加入50ul主混合液。
4．每個樣本取1．0ul scFv基因模板（約1ng）,，加入到主混合液中,。
5．取46u1主混合液分別加入到步驟2已制備的24個管內(nèi)。
6．預加熱PCR反應(yīng)格到94℃,。
7．以94℃ 1分鐘,、55℃ 1分鐘、72℃1分鐘的條件共循環(huán)25次,，擴增接頭序列,。
8．將PCR產(chǎn)物用2．0％TBE瓊脂糖膠電泳純化，切取PCR產(chǎn)物,；用Geneclean抽提,，并重懸DNA于50ul水中。
