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制備scFv接頭DNA

2012-9-2  閱讀(1516)

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器材和試劑]

●  PCR試劑和設(shè)備
●  1ug任何舍有scFv及(GIy4Ser)3接頭的載體
●  RHuJH引物,、RHuVκ引物和RHuVλ引物,,10pmol/ul
 
[方法]
1.在0.5ml微量離心管內(nèi)配制用于擴增的主混合液,。所顯示的主混合液用于VH—Vκ接頭,。對于VH—Vλ接頭的主混合液,,n=29,。
                        單個反應(yīng)主混合液/ul         (n=25)
●  水                     37                         925
●  10×Vent緩沖液        5.0                        125
●  20×dNTPs             2.5                        62.5
●  Vent DNA聚合酶        0.5                        12.5
2.取24支0.5ml試管,,每管分別加入RHuJH引物和RHuVκ引物,各2ul,。RHuJH引物和RHuVκ引物共有24種可能的結(jié)合形式,。而對于VH—Vλ接頭,,則用RHuVl引物替代RHuVκ引物即可,共可編為28管,。如無加熱蓋,,可以加入l滴輕質(zhì)礦物油覆蓋反應(yīng)液。
3.設(shè)1個陰性對照管,,加入50ul主混合液,。
4.每個樣本取1.0ul scFv基因模板(約1ng),加入到主混合液中,。
5.取46u1主混合液分別加入到步驟2已制備的24個管內(nèi),。
6.預(yù)加熱PCR反應(yīng)格到94℃。
7.以94℃ 1分鐘,、55℃ 1分鐘,、72℃1分鐘的條件共循環(huán)25次,擴增接頭序列,。
8.將PCR產(chǎn)物用2.0%TBE瓊脂糖膠電泳純化,,切取PCR產(chǎn)物;用Geneclean抽提,,并重懸DNA于50ul水中,。

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