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上海寶葉生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員·6年
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器材和試劑]
●大腸桿菌TGl菌株（Stratagen）
●37℃孵育箱（NewBrunswickScientmc）
●Sorvatl RC5離心機(jī)（或同類(lèi)型）,，GS3轉(zhuǎn)頭（均在4℃預(yù)冷）
●預(yù)冷的500m1聚丙烯離心管
●2L有擋板錐形瓶
●基本培養(yǎng)瓊脂板[10 5g K2HP04、4．5gKH2P04,、1g（NH4）2S04、0．5g Na3C6H5O72H2O,、15g瓊脂加水至幾,。高壓滅菌,，冷卻至錐形瓶微溫；接著加入lml lmol/L MgS04,、0．5ml 1%維生素B：（硫胺）和10m120%右旋糖,。
●2×Y培養(yǎng)基（將16g細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨、10g酵母,、5g NaCl加入到去離子水中并高壓滅菌）,。
●lmol/L Hepes，（N-[2-羥乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸]）,，pH 7．4
●lmol/L Hepes,，pH 7．4，10%甘油
●10%甘油
[方法]
1．將大腸桿菌TG1種到基本培養(yǎng)瓊脂板,，37℃過(guò)夜,。
2．將基本培養(yǎng)瓊脂板上的大腸桿菌TGl再接種到含有15m1 2XTY培養(yǎng)基的100ml形瓶中。37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,。
3．用5ml夜培養(yǎng)的TGl接種到兩個(gè)含500m1 2×Y培養(yǎng)基的2L有擋板錐形瓶中,。在搖床中培養(yǎng)約1．5小時(shí)，直到A600接近0．5,。
4．將菌液轉(zhuǎn)移4個(gè)預(yù)冷離心瓶中（約250ml/瓶）,。平衡后，置于冰上20分鐘,。
5．以3000g,，4℃離心15分鐘。使用前預(yù)冷所有轉(zhuǎn)頭,。
6,，棄去上清，并以起始體積的冰冷lmmol/L Hepes溶液（約250m1）重懸每個(gè)錐形瓶中的細(xì)胞,。所有溶液都應(yīng)當(dāng)新鮮配置,。
7．再次以3000g，4℃離心15分鐘,。
8．以一半起始體積的冰冷lmmol/L Hepes溶液（約125ml）重懸每個(gè)錐形瓶中的細(xì)胞,；此時(shí)可合并到兩個(gè)離心瓶中。
9．再次以3000g,，4℃離心15分鐘,。
10．以總體積為20m1的10%甘油和lmm01/L Hepes混合液重懸所有細(xì)胞。
11．再次以3000g,，4℃離心15分鐘,。
12．如果細(xì)胞不是新鮮使用而是儲(chǔ)存，則需準(zhǔn)備乙醇/干冰浴。
13．以總體積為2m1的10%甘油重懸細(xì)胞,。
14．使用新鮮制備的細(xì)胞,，或者用干冰浴等量分裝凍存細(xì)胞②。在檢測(cè)效率后,，及時(shí)使用細(xì)胞（在1周內(nèi)）。
用于電轉(zhuǎn)化的DNA不得含有鹽分,。細(xì)菌/DNA混合物中如有鹽分可導(dǎo)致電?。ㄒ环N短路）的形成，應(yīng)加以避免,?？傮w上，在70℃10分鐘的熱滅活步驟后,，可使用2/Il標(biāo)準(zhǔn)連接液進(jìn)行連接,。為構(gòu)建抗體文庫(kù)，所用DNA必須使用酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀法或選擇合適的試劑盒（例如Geneclean或Qiagen）進(jìn)行純化,。
