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電感受態(tài)大腸桿菌TGl的制備

2012-9-2  閱讀(1526)

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器材和試劑]

●大腸桿菌TGl菌株(Stratagen)
●37℃孵育箱(NewBrunswickScientmc)
●Sorvatl RC5離心機(jī)(或同類(lèi)型),,GS3轉(zhuǎn)頭(均在4℃預(yù)冷)
●預(yù)冷的500m1聚丙烯離心管
●2L有擋板錐形瓶
●基本培養(yǎng)瓊脂板[10 5g K2HP04、4.5gKH2P04,、1g(NH42S04、0.5g Na3C6H5O72H2O,、15g瓊脂加水至幾,。高壓滅菌,,冷卻至錐形瓶微溫;接著加入lml lmol/L MgS04,、0.5ml 1%維生素B:(硫胺)和10m120%右旋糖,。
●2×Y培養(yǎng)基(將16g細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨、10g酵母,、5g NaCl加入到去離子水中并高壓滅菌),。
●lmol/L Hepes,(N-[2-羥乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸]),,pH 7.4
●lmol/L Hepes,,pH 7.4,10%甘油
●10%甘油
 
[方法]
1.將大腸桿菌TG1種到基本培養(yǎng)瓊脂板,,37℃過(guò)夜,。
2.將基本培養(yǎng)瓊脂板上的大腸桿菌TGl再接種到含有15m1 2XTY培養(yǎng)基的100ml形瓶中。37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,。
3.用5ml夜培養(yǎng)的TGl接種到兩個(gè)含500m1 2×Y培養(yǎng)基的2L有擋板錐形瓶中,。在搖床中培養(yǎng)約1.5小時(shí),直到A600接近0.5,。
4.將菌液轉(zhuǎn)移4個(gè)預(yù)冷離心瓶中(約250ml/瓶),。平衡后,置于冰上20分鐘,。
5.以3000g,,4℃離心15分鐘。使用前預(yù)冷所有轉(zhuǎn)頭,。
6,,棄去上清,并以起始體積的冰冷lmmol/L Hepes溶液(約250m1)重懸每個(gè)錐形瓶中的細(xì)胞,。所有溶液都應(yīng)當(dāng)新鮮配置,。
7.再次以3000g,4℃離心15分鐘,。
8.以一半起始體積的冰冷lmmol/L Hepes溶液(約125ml)重懸每個(gè)錐形瓶中的細(xì)胞,;此時(shí)可合并到兩個(gè)離心瓶中。
9.再次以3000g,,4℃離心15分鐘,。
10.以總體積為20m1的10%甘油和lmm01/L Hepes混合液重懸所有細(xì)胞。
11.再次以3000g,,4℃離心15分鐘,。
12.如果細(xì)胞不是新鮮使用而是儲(chǔ)存,則需準(zhǔn)備乙醇/干冰浴。
13.以總體積為2m1的10%甘油重懸細(xì)胞,。
14.使用新鮮制備的細(xì)胞,,或者用干冰浴等量分裝凍存細(xì)胞②。在檢測(cè)效率后,,及時(shí)使用細(xì)胞(在1周內(nèi))。
用于電轉(zhuǎn)化的DNA不得含有鹽分,。細(xì)菌/DNA混合物中如有鹽分可導(dǎo)致電?。ㄒ环N短路)的形成,應(yīng)加以避免,??傮w上,在70℃10分鐘的熱滅活步驟后,,可使用2/Il標(biāo)準(zhǔn)連接液進(jìn)行連接,。為構(gòu)建抗體文庫(kù),所用DNA必須使用酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀法或選擇合適的試劑盒(例如Geneclean或Qiagen)進(jìn)行純化,。

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