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上海寶葉生物科技有限公司
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器材和試劑]
●大腸桿菌TGl菌株(Stratagen)
●37℃孵育箱(NewBrunswickScientmc)
●Sorvatl RC5離心機(或同類型),,GS3轉(zhuǎn)頭(均在4℃預(yù)冷)
●預(yù)冷的500m1聚丙烯離心管
●2L有擋板錐形瓶
●基本培養(yǎng)瓊脂板[10 5g K2HP04,、4.5gKH2P04、1g(NH4)2S04,、0.5g Na3C6H5O72H2O,、15g瓊脂加水至幾。高壓滅菌,,冷卻至錐形瓶微溫,;接著加入lml lmol/L MgS04、0.5ml 1%維生素B:(硫胺)和10m120%右旋糖,。
●2×Y培養(yǎng)基(將16g細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨,、10g酵母、5g NaCl加入到去離子水中并高壓滅菌),。
●lmol/L Hepes,,(N-[2-羥乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸]),pH 7.4
●lmol/L Hepes,,pH 7.4,,10%甘油
●10%甘油
[方法]
1.將大腸桿菌TG1種到基本培養(yǎng)瓊脂板,37℃過夜,。
2.將基本培養(yǎng)瓊脂板上的大腸桿菌TGl再接種到含有15m1 2XTY培養(yǎng)基的100ml形瓶中,。37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
3.用5ml夜培養(yǎng)的TGl接種到兩個含500m1 2×Y培養(yǎng)基的2L有擋板錐形瓶中,。在搖床中培養(yǎng)約1.5小時,,直到A600接近0.5。
4.將菌液轉(zhuǎn)移4個預(yù)冷離心瓶中(約250ml/瓶),。平衡后,,置于冰上20分鐘。
5.以3000g,,4℃離心15分鐘,。使用前預(yù)冷所有轉(zhuǎn)頭。
6,,棄去上清,,并以起始體積的冰冷lmmol/L Hepes溶液(約250m1)重懸每個錐形瓶中的細(xì)胞。所有溶液都應(yīng)當(dāng)新鮮配置,。
7.再次以3000g,,4℃離心15分鐘。
8.以一半起始體積的冰冷lmmol/L Hepes溶液(約125ml)重懸每個錐形瓶中的細(xì)胞,;此時可合并到兩個離心瓶中,。
9.再次以3000g,4℃離心15分鐘,。
10.以總體積為20m1的10%甘油和lmm01/L Hepes混合液重懸所有細(xì)胞,。
11.再次以3000g,4℃離心15分鐘,。
12.如果細(xì)胞不是新鮮使用而是儲存,,則需準(zhǔn)備乙醇/干冰浴。
13.以總體積為2m1的10%甘油重懸細(xì)胞,。
14.使用新鮮制備的細(xì)胞,,或者用干冰浴等量分裝凍存細(xì)胞②。在檢測效率后,,及時使用細(xì)胞(在1周內(nèi)),。
用于電轉(zhuǎn)化的DNA不得含有鹽分。細(xì)菌/DNA混合物中如有鹽分可導(dǎo)致電?。ㄒ环N短路)的形成,,應(yīng)加以避免??傮w上,,在70℃10分鐘的熱滅活步驟后,可使用2/Il標(biāo)準(zhǔn)連接液進(jìn)行連接,。為構(gòu)建抗體文庫,,所用DNA必須使用酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀法或選擇合適的試劑盒(例如Geneclean或Qiagen)進(jìn)行純化。