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基本信息
異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）
純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水和酒精溶劑,。有兩種異構(gòu)體,，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良,。FITC分子量為389.4,，zui大吸收光波長為490～495nm，zui大發(fā)射光波長為525～530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用zui廣泛的熒光素,。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對黃綠色較為敏感,，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。
FITC 是在熒光素的基礎(chǔ)上通過化學(xué)反應(yīng)增加硫氰酸基團(tuán)得到的,，硫氰酸基團(tuán)可以和生物活性物質(zhì)例如蛋白質(zhì)上的伯胺基團(tuán)反應(yīng)形成硫脲鍵,，從而實(shí)現(xiàn)對生物活性物質(zhì)的熒光標(biāo)記
　　

FITC相關(guān)事項(xiàng)
分子式：C21H11NO5S
分子量：389.38
性質(zhì)：
1. 外觀：黃色粉末
2. 純度：≥95% （HPLC）

3. 產(chǎn)品描述：FITC能和各種抗體蛋白結(jié)合，結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性,，并在堿性溶液中具有強(qiáng)烈的黃綠色熒光,。通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測,。用于醫(yī)學(xué)，農(nóng)學(xué)和畜牧等方面,，可對由細(xì)菌病毒和寄生蟲等所致疾病進(jìn)行快速診斷,。
4. FITC標(biāo)記抗體流程：
（1）將待交聯(lián)的蛋白（濃度≥1mg/ml）對交聯(lián)反應(yīng)液透析三次4℃，至pH=9.0,。交聯(lián)反應(yīng)液配制方法：7.56g NaHCO3,，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl,，加水定容至1 L,。
（2）將FITC溶于DMSO中，濃度為1mg/mL,。每次交聯(lián)使用的FITC均應(yīng)新鮮配制,，避光。
（3）按P:F（蛋白質(zhì):FITC）=1mg:150μg 的比例將FITC緩慢加入于抗體溶液中,，邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻,，暗處4 ℃反應(yīng)8 h。
（4）加入5mol/L的NH4Cl至終濃度50mmol/L,， 4 ℃終止反應(yīng)2 h,。
（5）將交聯(lián)物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮,。
（6）交聯(lián)物的鑒定
　蛋白濃度（mg/mL） = [ A280– 0.31×A495 ] / 1.4
　F/P比例: 3.1×A495 / [A280 – 0.31×A495 ],，該值應(yīng)介于2.5 ~ 6.5之間,。
（7）FITC交聯(lián)的蛋白應(yīng)置于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入0.1% NaN3,、1% BSA,，4℃避光保存。 儲存條件：4℃避光保存
FITC是一種常用的綠色熒光探針,。FITC的吸收（激發(fā)）和發(fā)射峰參見下表,。
Fluorophore Absorption Peak（nm） Emission Peak（nm）
FITC 492 520
當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應(yīng)時(shí)，主要是蛋白質(zhì)上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵（thiocarbmide）結(jié)合,，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物,，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個(gè)IgG分子中有86個(gè)賴氨酸殘基,，一般zui多能結(jié)合15～20個(gè),，一個(gè)IgG分子可結(jié)合2～8個(gè)分子的FITC，其反應(yīng)式如下
FITC-N=C=S + N-H2-蛋白質(zhì) → FITC-NS-C-N-H2-蛋白質(zhì)
常用Marsshall（1958）法標(biāo)記熒光抗體,，也可以根據(jù)條件采用Chadwick等標(biāo)記法或Clark等（1963）的透析標(biāo)記法,。
1．Marsshall法
（1）材料 抗體球蛋白溶液、0．5mol／L（pH9．0）碳酸鹽緩沖液,、無菌生理鹽水,、異硫氰酸熒光
素、1％硫柳汞水溶液,、50ml小燒杯,、4℃冰箱、電磁攪拌器,、透析袋,、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等,。
（2）方法及步驟 ①抗體的準(zhǔn)備 取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中,，再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使zui后免疫球蛋白濃度為20mg／ml,，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1／10,，混勻，將燒瓴置電磁攪拌器上（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min,。
②熒光素的準(zhǔn)備 根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量,，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg熒光色素，用分析天平準(zhǔn)確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末,。也可用下述公式計(jì)算出免疫球蛋白,、熒光素的量，還可以算出需加緩沖液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1,；容積Bml,。
b．總蛋白量（AXB）＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg（如蛋白含量低于20mg／ml,，用C／10,；如高于20mg／ml，用C／20）,。
d．熒光素FITC的量：（1／50～2／100）XC＝Emg,。
e．巳0．5mol／L（pH9．5）碳酸鹽緩沖液D／10＝Fml。
f． PBS量D-（B+F）=Gml,。
注：A為蛋白含量,，mg／ml；B為蛋白質(zhì)溶液的容積,；C為蛋白總量,，mg；D為常數(shù),，mg,；正為熒光素的量，mg,；F為碳酸鹽緩沖液的容積,，ml；G為PBS的容積,，ml,。
③結(jié)合（或標(biāo)記） 邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁（大約在5—10min內(nèi)加完）,，加完后，繼續(xù)避光攪拌12h左右,。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析 結(jié)合完畢后,，將標(biāo)記的球蛋白溶液離心（2500r／min）20rain,，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中,，再置于燒杯中,，用pH8．0緩沖鹽水透析（0～4~C）過夜。
⑤過柱 取透析過夜的標(biāo)記物,，通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱,，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定,。洗脫液：0．01mol／L磷酸鹽緩沖液（pH7．2）,；過濾量：12ml標(biāo)記蛋白液（過濾前未透析）,；收集量：20ml（稀釋1．7倍左右）。
2．Chadwick法
（1）試劑和材料 抗體球蛋白溶液,、異硫氰酸熒光素,、3%碳酸鈉水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS,、1%硫柳汞,、離心機(jī)及離心管、燒杯（25ml）攪拌器,、無菌吸管,，無菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯（500ml）透析袋等,。
（2）方法及步驟 ①抗體準(zhǔn)備 用o～4~C的pH8,。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg／ml，置入25ml燒杯內(nèi),，放于冰槽中,。
②熒光色素準(zhǔn)備 按每毫克免疫球蛋白加入熒光素0．01rug計(jì)算，稱取所需的熒光素,，用3％碳酸鈉水溶液溶解,。
③將準(zhǔn)備的抗體與熒光色素溶液等量混合，充分?jǐn)噭?，在o～4~C冰箱中結(jié)合（在磁力攪拌機(jī)上持續(xù)攪拌）18～24h,。
④透析和柱層析 方法同Marsshall法。
3．改良法
（1）試劑和材料 ①0．01mol／L（pH7．2）PBS配法中,，校定pH至7．2,。NaCi 18g、Na2HP04 1．15g,，溶于2000ml蒸餾水
②0．5mol／L（pH9．0）碳酸鹽緩沖液配法 取0．5mol／LNazCOs（5．3％）10ml加入0．5mol／LNaHC03（4．2％）90ml,，混合后，校定pH至9．0,。
③3％碳酸鈉水溶液配法 稱L 5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成,。
④其他試劑和材料 l％*、離心機(jī)及離心管,、燒杯（25m1）,、攪拌器、無菌吸管及毛細(xì)滴管,、燒杯（500m1）透析袋等,。
（2）方法及步驟 ①取價(jià)的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水（0．15mol／LNaCl）及緩沖液（0．5mol／LNaHC03—Na2C03,，pH9．0）稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白質(zhì)lOmg,，緩沖液為總量的10％，降溫至4℃,。
②加入異硫氰酸鹽（FITC）熒光素[蛋白：熒光素＝（50—80）mg‘lmg],，在0～4~C
下電磁攪拌12～14h。
③然后用半飽和的硫酸銨將標(biāo)記球蛋白沉淀分離,，除去未結(jié)合的熒光素,，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨（用Nessler試劑測驗(yàn),，至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止）,。
④將制備好的熒光抗體加*o．01％，分裝在lml安瓿中,，或凍干,，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，一20~C保存可達(dá)2年以上,。
4．透析標(biāo)記法

此法適用于小量抗體的熒光素標(biāo)記,，標(biāo)記簡便，非特異性染色較少,。
（1）試劑和材料 試劑和材料同改良法,。
（2）方法及步驟 ①用0．025mol／L碳酸鹽緩沖液pH9．0，將欲標(biāo)記免疫球蛋白稀釋成1％濃度,，裝入透析袋中,。
②用同一緩沖液將FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液體積的10倍,，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi),，并使透析袋浸沒于FITC液中。
③容器頂端蓋緊,，底部放攪拌棒,，在4~C電磁攪拌下透析標(biāo)記24h。取出透析袋中標(biāo)記液,，即刻用SephadexG50凝膠過濾，去除游離熒光素,，分裝,，貯存于4℃中。