黃曲霉素(AFT)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

              試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用,。 

 聲明：應(yīng)國家相關(guān)部門關(guān)于違禁字的規(guī)定本文中黃曲霉堵素中的毒以堵替代

1 使用目的：

本試劑盒用于飼料,、魚、蝦和肉類組織（如雞,、牛肉和豬肉）,，雞蛋、蜂蜜,、牛奶,、血清和尿樣中總黃曲霉堵素(AFT)殘留的定量檢測。

2 實(shí)驗原理

本試劑盒采用直接競爭 ELISA 方法,，在微孔板包被有黃曲霉素偶聯(lián)抗原,，加入黃曲霉堵素(AFT)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離黃曲霉堵素(AFT)與微孔條上預(yù)包被的黃曲霉堵素(AFT)偶聯(lián)抗原互相競爭抗黃曲霉堵素(AFT)抗體酶標(biāo)記物,，用 TMB 底物顯色,，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下進(jìn)行檢測,，吸光值與樣品中黃曲霉堵素(AFT)含量成反比,，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中黃曲霉堵素(AFT)的含量。

3 試劑盒組成

• 預(yù)包被的 AFT 偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1 塊（12 孔×4 條）,。

• AFT 標(biāo)準(zhǔn)品：6 瓶（1ml/瓶）,，含量分別是： 0 ng/ml，0.1 ng/ml,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7ng/ml,8.1 ng/ml,。

抗 AFT 抗體酶結(jié)合物：1 瓶（3ml）,。

顯色液 A：1 瓶（3ml）。

顯色液 B：1 瓶（3ml）,。

終止液：1 瓶（3ml）,，2M 硫酸。

樣本稀釋液：1 瓶（10×,  3ml）,，用于樣品稀釋用,。

濃縮洗滌液：1 瓶（20×，20ml）,，用于洗板,。

說明書一份。

4 需要而未提供的材料

4.1 設(shè)備

4.1.1波長450nm酶標(biāo)儀,。4.1.2粉碎機(jī),。4.1.3量筒,。4.1.4振蕩器。4.1.5漏斗,。

4.1.6Whatman 或相當(dāng)?shù)臑V紙,。

4.1.7微量移液器。

4.2 試劑

4.2.1去離子水或蒸餾水,。

4.2.2 甲醇,。

5 貯存

試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍

未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存

6 注意事項

使用試劑盒前請仔細(xì)閱讀說明書,。

不要使用過期試劑盒。

試劑盒使用前,，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃）,，建議至少回溫2小時。

標(biāo)準(zhǔn)品中含有黃曲霉素,，使用時應(yīng)特別注意,，操作時應(yīng)帶手套。

終止液中含有硫酸,，使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物,。

不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用,，否則會影響試驗結(jié)果,。

不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品,、樣品所用吸頭不得混用,，否則會影響實(shí)驗結(jié)果。

稀釋樣本時必須用本試劑盒中的樣本稀釋液,，否則會影響實(shí)驗結(jié)果

混合試劑時應(yīng)避免起泡,。

7 工作液準(zhǔn)備

• AFT標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ng/ml,0.1ng/ml ,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7 ng/ml,8.1ng/ml
• 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用
• 樣本稀釋液：備用
• 顯色劑：已備用，避免光線直照
• 反應(yīng)終止液：已備用

8 樣品處理程序（樣品在提取過程中,，要嚴(yán)格按說明書操作,，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則會出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確,，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）

8.1取10g粉碎的樣品,，加 20ml 70%甲醇溶液

8.2強(qiáng)力振蕩3分鐘

8.3用Whatman 濾紙過濾

8.4取25µl處理后的樣品，加入25µl樣本稀釋液于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2）

9 酶免分析步驟

9.1 實(shí)驗須知

• 實(shí)驗開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃）,，時間約2小時,。回溫至室溫（25±2℃）后再取出微孔條,，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存注：一定保證回溫充分,，否則影響檢測的精確度和準(zhǔn)確度,。
• 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存
• 請不要改變分析程序
• 請使用精確的微量移液器
• 操作一旦開始，請不要中斷任何程序
• ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序,，請嚴(yán)格按照要求操作
• 為避免交叉污染,，每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣

• 加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面

9.2 分析步驟

• 預(yù)先進(jìn)行編號，標(biāo)記B0,、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置,，推薦進(jìn)行雙孔檢測
• 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存
• 樣品稀釋液（10×）,、濃縮洗滌液（10×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)
• 在B0孔中加入50µl0.0 ng/ ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液
• 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50µl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液
• 在各樣品孔中加入50µl樣品溶液
• 在所有孔中加入50µl的抗黃曲霉素B1抗體酶結(jié)合物
• 輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘,。

9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）

9.3.1 甩掉孔中液體,，用洗液洗滌微孔板5次,，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液

體。

9.4 反應(yīng)

• 洗滌程序完成后,，立即用微量移液器在每個微孔中先加入50µl顯色液A,，再加 50µl顯色液B；輕微晃動反應(yīng)板使之*混勻
• 37℃溫浴10min
• 每孔中加入50µl終止液,，混勻
• 在450nm下檢測吸光度,，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。
• 結(jié)果計算

10.1定量分析

10.1.1所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%,，即百分吸光度值,。B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0—0µg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

10.1.2以黃曲霉素B1濃度的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,。根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo),，即為AFT濃度的對數(shù)值,，求得反對數(shù)即為測定液中AFT濃度C（ng/ml）

10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù),。

10.2 半定量測定

10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行,，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值,。10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行,，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值,。

• 特異性

物質(zhì) 交叉反應(yīng)黃曲霉素B1 100% 黃曲霉素B2 80% 黃曲霉素G1 75% 黃曲霉素G2 30%

12 試劑盒參數(shù)

本試劑盒檢測下限為0.1ppb B0吸光度*值應(yīng)大于1.0試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％,，板間誤差小于15％。

用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％,。

13試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1ng/ml~8.1ng/ml,。

14 分析限制

本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證,。