OCT冰凍切片包埋劑(O.C.T. Compound)

OCT冰凍切片包埋劑是一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物,，目前已廣泛用于免疫組化實(shí)驗(yàn)中,，其用途是在冰凍切片時(shí)支撐組織，以增加組織的連續(xù)性,，減少皺折及碎裂,。又回OCT混合物為水溶性，故在漂片時(shí)可溶于水,，所以在以后的染色中不會(huì)增加背景染色,。利用OCT混合物（opti-mum cutting temperature compound）預(yù)先浸潤(rùn)組織，然后再進(jìn)行恒冷箱切片,，使切片質(zhì)量得到改善,。

OCT包埋劑（SAKURA產(chǎn)品，MADE IN USA）包埋流程：

1,，將放在蔗糖溶液中的組織塊取出,，放入20g　L-1　蔗糖與OCT包埋劑1：1體積比例混合液中,，室溫浸泡2h

2,，移入OCT包埋劑中室溫浸泡4h，更換新的OCT包埋劑,，室溫浸泡6h.

3,，將標(biāo)本置于托物臺(tái)，用恒冷箱切片機(jī)切片（一般－22℃）,，片厚10μm,貼于預(yù)處理的載玻片上,，－20℃冰箱保存。

組織采樣

1.從每個(gè)福爾馬林固定石蠟包埋的標(biāo)本上切下50 µm的切片,。每塊標(biāo)本至少要有兩個(gè)切片,，如果需要更多的細(xì)胞，則增加切片數(shù)量,。每次從組織塊取樣之前和之后,，按照5µm大小進(jìn)一步分割，分出正常和惡性組織,。

2.將分開(kāi)的小切片放入10 mL管中,。給管子貼上編號(hào)和「正常」「腫瘤」等標(biāo)識(shí)

脫蠟

注意：在化學(xué)通風(fēng)櫥中執(zhí)行以下脫蠟步驟,。

1.通過(guò)向管中加入至少2至3 mL AmeriClear【AmeriClear histology clearing solvent (Scientific Products Cat. No. C4200-1)】,，開(kāi)始對(duì)切片進(jìn)行脫蠟或脫蠟處理,。在孵育步驟中，應(yīng)有足夠的試劑*覆蓋石蠟切片,。

2.劇烈渦旋震蕩樣品,。與AmeriClear孵育的時(shí)間大約為10至15分鐘，長(zhǎng)為3小時(shí),。在移除試劑之前,，請(qǐng)用移液管小心地將切片向上拉到試管的側(cè)面，以保持組織完整,。吸出剩余的試劑,。

3.再加入2至3 mL AmeriClear，短暫渦旋,，然后孵育10分鐘,。確保組織切片被試劑覆蓋。流程如上所述,。在進(jìn)行復(fù)水步驟之前,，請(qǐng)檢查每個(gè)管子是否透明，這表明石蠟已*溶解,。

復(fù)水

以下步驟對(duì)于組織的適當(dāng)復(fù)水至關(guān)重要,，如果執(zhí)行不正確，可能會(huì)導(dǎo)致樣品制備過(guò)程中碎屑增加,。注意：在執(zhí)行一個(gè)復(fù)水步驟時(shí),，如果酒精看起來(lái)渾濁或有明顯的蠟沉淀存在，請(qǐng)通過(guò)在AmeriClear中孵育30分鐘以除去殘留的石蠟來(lái)除去酒精并執(zhí)行額外的脫蠟步驟,。然后繼續(xù)補(bǔ)液步驟,。

1.使用以下每種乙醇溶液3 mL：100％，95％,，70％和50％的順序洗滌,，對(duì)切片進(jìn)行復(fù)水。加入每種新的乙醇溶液后,，渦旋標(biāo)本,，并在室溫（20°至25°C）下孵育至少10分鐘。在添加下一個(gè)溶液之前,，先吸出每種溶液,，在移液之前將切片向上拉到試管的側(cè)面，以保持組織切片的完整性,。注意：如果組織脆或很小,，則可能很難將組織拉到管壁上。必須注意防止過(guò)多的細(xì)胞丟失,。

2.加入3 mL純水完成復(fù)水,。輕輕吸取殘留液體并加入純水以消除殘留的酒精,。在室溫（20°至25°C）下，將組織放在水中過(guò)夜,。

解離

1.輕輕吸去純水并重懸于2 mL 1X PBS中,，同時(shí)準(zhǔn)備胃蛋白酶（10分鐘）。

2.輕輕吸出1X PBS,，并在每個(gè)試管中加入至少2 mL新鮮制備的0.5％胃蛋白酶溶液,。以中等速度渦旋約30秒，以確保組織被重懸,。

3.將試管在37°C水浴中孵育1小時(shí),。每10分鐘搖動(dòng)或輕輕搖動(dòng)試管一次，并檢查上清液的濁度,。對(duì)于某些組織,，可能需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間以增加細(xì)胞的回收率。一些組織,，例如脾臟和淋巴結(jié),，可能只需要20分鐘即可使上清液變渾濁。這也將取決于酶的活性,。

染色

1.通過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液,，用1-2 mL的1X PBS沖洗樣品管一次，然后倒入濾網(wǎng)中,。用尖頭鑷子擠壓濾網(wǎng)以增加細(xì)胞產(chǎn)量,。

2.在室溫下（20°至25°C）以400 x g離心細(xì)胞懸液5分鐘。小心除去上清液,。

3.輕輕地將細(xì)胞沉淀重懸于1 mL的1X PBS中,，并使用光學(xué)顯微鏡在血球計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)細(xì)胞,。將細(xì)胞濃度調(diào)整至大5.0 x 10E5細(xì)胞/mL,。