pUC-T TA快速連接試劑盒（含載體,，連接酶）說明書

pUC-T Quick Ligation Kit

pUC-T TA快速連接試劑盒（含載體,，連接酶）

目錄號：YJ2591

保存條件：-20℃保存。

組分說明

                Cat. No.                            YJ2591

                Size                                  20次

                pUC-T（50 ng/μl）                       20 μl

                Conctrol Insert (50 ng/μl)            10 μl

                Quick T4 DNA Ligase                   20 μl

                2×Quick Ligation Reaction Buffer     120 μl

              本產(chǎn)品僅供科研使用,，請勿用于臨床診斷及其他用途  

產(chǎn)品簡介

　　pUC-T TA載體是一種克隆PCR產(chǎn)物的載體,，它是由pUC18載體在EcoR V

酶切位點(diǎn)處切開，在兩側(cè)的3′端添加T而成,。由于大部分耐熱聚合酶反應(yīng)時(shí)都會在 PCR

產(chǎn)物的3′端添加一個A,，它可以與pUC-T 3′端的T互補(bǔ)連接，因此可大大提高PCR產(chǎn)物的連接和克隆效率,。

　試劑盒中配備率的T4 DNA Ligase和為快速DNA連接優(yōu)化的2×Quick Ligation 

Reaction Buffer,。連接效率相當(dāng)于用T4 DNA Ligase 進(jìn)行常規(guī)連接1小時(shí)。帶有插入片

段的重組子可根據(jù)α互補(bǔ)原理,，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,，判斷載體中有無外源基因的插入?？?/SPAN>

隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,。

注意事項(xiàng)

1．Insert DNA 要求

   1）連接使用的PCR片段3’末端應(yīng)帶有“A"尾。有些高保真DNA聚合酶,，如我公司的  Pfu擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物是平滑末端,，可使用加A試劑盒加上A尾后，再進(jìn)行T載體克隆,。

   2）PCR產(chǎn)物建議進(jìn)行切膠回收純化后再進(jìn)行T載體克隆,，以免PCR產(chǎn)物中的非特異片

   段或殘存引物等雜質(zhì)影響。推薦使用  YJ2302/YJ0524/YJ0518 快速瓊脂糖凝膠

   DNA回收試劑盒,。

2．連接反應(yīng)要求

   1）本試劑盒能使大多數(shù)連接反應(yīng)在25℃條件下5分鐘甚至更短時(shí)間內(nèi)達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn),，

   增加反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)效率不會增強(qiáng),。如用快速連接反應(yīng)  1小時(shí)后，轉(zhuǎn)化效率會明顯降

   低,；如25℃快速連接反應(yīng)過約夜,，則轉(zhuǎn)化效率會下降到75%。

   2）2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP,，使用前置于冰上使其融化后充分混

   勻,，建議初次使用分裝成小管凍存，避免其反復(fù)凍融影響DNA連接效率,。

   3）由于T4 DNA Ligase中含有甘油,，比較粘稠容易掛壁，建議使用之前短暫離心將

   液體收集到管底,，取樣時(shí)槍頭盡量不要深入液面太深,，以免粘在槍頭上造成損失。

   4）如快速連接產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn),，因快速連接反應(yīng)體系中的PEG會影響電轉(zhuǎn)效率,，建議

   使用離心柱將連接產(chǎn)物進(jìn)行DNA純化（如YJ2301快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒）后再

   進(jìn)行電轉(zhuǎn)。

3．感受態(tài)細(xì)胞要求

   建議使用的熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,，這樣才可能得到比較理想的陽性克隆,，如需  

   進(jìn)行藍(lán)白篩選，宿主細(xì)胞必須具有正確的基因型（F′編碼的【lacZ ΔM15】）產(chǎn)生ω片

   段,，才能與載體DNA產(chǎn)生的LacZ  α多肽結(jié)合,，表現(xiàn)出β-半乳糖苷酶活性（α互補(bǔ)）。

   pUC-T  TA載體以pUC18載體為基礎(chǔ)構(gòu)建而成,，因此,，適合pUC18載體的感受態(tài)細(xì)胞都可以使用。推薦使用本公司YJ0807 *0感受態(tài)細(xì)胞,、YJ0808 DH5α感受態(tài)細(xì)胞,。

4．陽性克隆篩選

   陽性DNA片段成功插入至pUC-T Vector中后，一般情況下β-半乳糖苷酶的表達(dá)將受

   到破壞,，重組克隆體在含有X-Gal,、IPTG、Amp的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)將顯示白 

   色菌落,。但有時(shí)比較短的DNA片段插入載體時(shí),，基因的讀碼框有可能正好與LacZ的 

   讀碼框相吻合，克隆體也會顯示藍(lán)色菌落,。

5．陽性對照

   為了確認(rèn)實(shí)驗(yàn)操作的正確性,，以及實(shí)驗(yàn)試劑的有效性，我們建議使用本試劑盒中配

   備的Control Insert（750 bp）進(jìn)行陽性對照實(shí)驗(yàn)。

使用方法

1．按以下體系配制反應(yīng)液：

             成分                              反應(yīng)體系          對照體系

             pUC-T                             1 μl          1 μl

             DNA插入片段   *                   0.1 -0.3 pmol      --

             Control Insert DNA                 --           1 μl

             2×Quick Ligation Reaction  Buffer 5 μl          5 μl

             Quick T4 DNA Ligase               1 μl          1 μl

             RNase-Free Water               補(bǔ)足至 10 μl     補(bǔ)足至 10 μl

     *Insert DNA的使用量：在進(jìn)行克隆時(shí),，Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為：1:2-1:10,，

     可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況選擇適當(dāng)?shù)腣ector DNA和Insert DNA的摩爾數(shù)比。Insert DNA的使用量=nmol數(shù)×660×Insert DNA bp數(shù),。本載體1 ml（50  ng）的摩爾數(shù)約為0.03 pmol,。

2．輕輕混合，短暫離心,。25℃反應(yīng)5分鐘,。

   注意：反應(yīng)時(shí)間不要超過15分鐘，否則會降低連接效率,。

3．反應(yīng)結(jié)束后,，將DNA連接產(chǎn)物存放于0-4℃，而后進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),；也可將  DNA連接

   產(chǎn)物置于-20℃保存,。

   注意：勿進(jìn)行加熱失活反應(yīng)。

4．將連接產(chǎn)物加入50 μl感受態(tài)細(xì)胞中（將感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化）,，冰浴30分鐘。

   注意：用化學(xué)法轉(zhuǎn)化時(shí),，連接產(chǎn)物的加入量不要超過感受態(tài)細(xì)胞體積的10%,。

5．42℃熱擊45秒鐘，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中,，冰上靜置2-3分鐘,。

6．加入450 μl無菌SOC或LB培養(yǎng)基，混勻后置于37℃搖床,，150 rpm振蕩培養(yǎng)45分鐘,，

   使菌體復(fù)蘇。

7．根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,，取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞,，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固體

   培養(yǎng)基上,，用無菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開,，將平板置于37℃，直至液體被吸收后,，

   倒置培養(yǎng),，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。

8．計(jì)算白,、藍(lán)色菌落,，挑選白色菌落，使用PCR法或酶切法鑒定插入片段是否正確。