雞 β干擾素(IFN-β) 試劑盒說(shuō)明書(shū)

本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測(cè)定雞血清,，血漿及相關(guān)

液體樣本中β干擾素(IFN-β)的含量。

實(shí)驗(yàn)原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中雞 β干擾素(IFN-β)水平,。用純化的雞 β干擾素 (IFN-β)抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入 β干擾素,，再與 HRP標(biāo)記的 IFN-β抗體結(jié)合，形成抗體 -抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物 TMB顯色,。TMB在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的 β干擾素(IFN-β)呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在 450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（ OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中雞 β干擾素(IFN-β)濃度,。

試劑盒組成：

樣本處理及要求： 

1.  血清：室溫血液自然凝固 10-20分鐘,，離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。 

2.  血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合 10-20分鐘后,，離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心,。 

3.  尿液：用無(wú)菌管收集，離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行,。 

4.  細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無(wú)菌管收集。離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉(zhuǎn)/ 

分）,。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達(dá)到 100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心 20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。 

5.  組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱(chēng)取重量,。加入一定量的 PBS,，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持 2-8℃的溫度,。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心 20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待檢測(cè),，其余冷凍備用,。 

6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于 -20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融 . 

7.  不能檢測(cè)含 NaN3的樣品,，因 NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（ HRP）活性。

操作步驟： 

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10孔,，在*,、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品 100μl，然后在*,、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,，混勻；然后從*孔,、第二孔中各取 100μl分別加到第三孔和第四孔,，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,，混勻,；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl棄掉，再各取 50μl分別加到第五,、第六孔中,，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50ul,，混勻,；混勻后從第五、第六孔中各取 50μl分別加到第七,、第八孔中,，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,，混勻后從第七,、第八孔中分別取 50μl加到第九、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,，混勻后從第九第十孔中各取 50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl,，濃度分別為 48ng/L,，32ng/L，16ng/L,，8ng/L,， 4ng/L）,。 

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）,、待測(cè)樣品孔,。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測(cè)樣品 10μl（樣品zui終稀釋度為 5倍）,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻,。 

3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 3 0分鐘。 

4. 配液：將 30（48T的 20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（48T的 20倍）倍稀釋后備用,。 

5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿(mǎn)洗滌液,，靜置 30秒后棄去，如此重復(fù) 5次,，拍干,。 

6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外,。 

7. 溫育：操作同 3,。 

8. 洗滌：操作同 5。 

9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl,，再加入顯色劑 B50μl,，輕輕震蕩混勻， 37℃避光顯色15分鐘. 

10. 終止：每孔加終止液 50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。 

11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零， 450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（ OD值）,。測(cè)定應(yīng)在加終止液后 15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行,。

注意事項(xiàng)： 

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。 

2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果,。 

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,，以避免試驗(yàn)誤差,。一次加樣時(shí)間控制在 5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。

4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本 OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD值）,，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n倍）后再測(cè)定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。 

5．封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染,。 

6．底物請(qǐng)避光保存。 

7．嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行,，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn) . 

8．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。 

9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用,。 

10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異,，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

計(jì)算：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),， OD值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度,。

（此圖僅供參考）

試劑盒性能： 

• 樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R值為 0.95以上,。 
• 批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于 9%和 11%

檢測(cè)范圍： 

3ng/L -60ng/L

保存條件及有效期： 

1 2-8℃。 

2 6個(gè)月