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上海研謹生物科技有限公司

大鼠組胺(Histamine)ELISA試劑盒說明書

時間:2014-2-3閱讀:704
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大鼠組胺(Histamine)ELISA試劑盒說明書
本試劑僅供研究使用       目的:本試劑盒用于測定大鼠血清,,血漿及相關液體樣本中組胺(Histamine)的含量。
組胺實驗原理:
   本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠組胺(Histamine)水平。用純化的大鼠組胺(Histamine)抗體包被微孔板,制成固相抗體,,往包被單抗的微孔中依次加入組胺(Histamine),再與HRP標記的組胺抗體結(jié)合,,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,,經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的組胺(Histamine)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),,通過標準曲線計算樣品中大鼠組胺(Histamine)濃度,。

組胺試劑盒組成:
 
試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存   
說明書 1份 1份    
封板膜 2片(48) 2片(96)    
密封袋 1個 1個    
酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存   
標準品:18μg/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存   
標準品稀釋液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存   
酶標試劑 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存   
樣品稀釋液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存   
顯色劑A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存   
顯色劑B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存   
終止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存   
濃縮洗滌液 (20ml×20倍)×1瓶 (20ml×30倍)×1瓶 2-8℃保存

樣本處理及要求:
1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),。仔細收集上清,,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應再次離心,。
2. 血漿:應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),。仔細收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心,。
3. 尿液:用無菌管收集,,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,,應再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,,用無菌管收集,。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,。檢測細胞內(nèi)的成份時,,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,,以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,,應再次離心。
5. 組織標本:切割標本后,,稱取重量,。加入一定量的PBS,PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),,用手工或勻漿器將標本勻漿充分,。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,。分裝后一份待檢測,,其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取,,提取按相關文獻進行,,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,,可將標本放于-20℃保存,,但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性,。

操作步驟:
標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔,,在*、第二孔中分別加標準品100μl,,然后在*,、第二孔中加標準品稀釋液50μl,混勻,;然后從*孔,、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三,、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,,再各取50μl分別加到第五,、第六孔中,,再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,,混勻,;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七,、第八孔中,,再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,,混勻后從第七,、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,,濃度分別為12μg/L,,8μg/L ,4μg/L,,2μg/L,, 1μg/L)。
加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,,其余各步操作相同),、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,,然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5倍),。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,,輕輕晃動混勻,。
溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用,。
洗滌:小心揭掉封板膜,,棄去液體,甩干,,每孔加滿洗滌液,,靜置30秒后棄去,如此重復5次,,拍干,。
加酶:每孔加入酶標試劑50μl,,空白孔除外,。
溫育:操作同3,。
洗滌:操作同5。
顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,,再加入顯色劑B50μl,,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.
終止:每孔加終止液50μl,,終止反應(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色),。
測定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值),。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行,。

注意事項:
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,,板條應裝入密封袋中保存,。
濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,,洗滌時不影響結(jié)果,。
各步加樣均應使用加樣器,并經(jīng)常校對其準確性,,以避免試驗誤差,。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,,推薦使用排槍加樣,。
請每次測定的同時做標準曲線,做復孔,。如標本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值),,請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5),。
封板膜只限一次性使用,,以避免交叉污染。
底物請避光保存,。
嚴格按照說明書的操作進行,,試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理,。
本試劑不同批號組分不得混用,。
計算:
以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,,   
在坐標紙上繪出標準曲線,,根據(jù)樣品的OD     
值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋     
倍數(shù),;或用標準物的濃度與OD值計算出標     
準曲線的直線回歸方程式,,將樣品的OD值     
代入方程式,,計算出樣品濃度,再乘以稀釋     
倍數(shù),,即為樣品的實際濃度,。
試劑盒性能:
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.92以上。
2.批內(nèi)與批間應分別小于9%和15%
保存條件及有效期:
1.試劑盒保存:,;2-8℃,。
2.有效期:6個月
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