大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

• 細(xì)菌分離純化：無菌采集肝臟劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,，伊美蘭瓊脂培養(yǎng)基中,，37℃恒溫培養(yǎng)12-24h,，用普通培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng),；
• 細(xì)菌形態(tài)特征：無菌挑去上述純化培養(yǎng)菌，革蘭氏染色鏡檢

電鏡觀察：FQ-180菌液培養(yǎng)7h后,，3000r/min離心5min,，棄上清，ddH₂O洗滌2次重懸,，取15ul滴在Formver膜覆蓋在銅網(wǎng)上,，2min后滴加磷鎢酸負(fù)染2min，待銅網(wǎng)烘干后,，在投射電子顯微鏡下觀察

• 生化試驗：將初步分離到的可疑菌落進(jìn)行吲哚試驗,，MR試驗，VP試驗,，淀粉E試驗,，枸櫞酸鈉利用試驗，乳糖,、麥芽糖,、蔗糖、木糖,、葡萄糖,、甘露糖、甘露醇發(fā)酵試驗,，產(chǎn)硫化氫試驗,，尿素酶試驗,，觸酶試驗，運動性試驗,，三塘鐵斜面穿刺試驗（或用ATB全自動生化鑒定系統(tǒng)和ID32E腸道菌鑒定試劑條進(jìn)行生化試驗）
• 藥敏試驗：按照美國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行實驗操作和結(jié)果判斷（所采用的抗生素見圖1）
• 血清型鑒定：采用玻板凝集反應(yīng)對分離株進(jìn)行血清型鑒定,，先用多因子血清通過玻板凝集試驗篩選可能的血清型，然后再與大腸桿菌單因子血清各10ul在玻板上混勻,，30S內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng),，同時以菌液與0.5%碳酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝現(xiàn)象
• PCR鑒定：將分離純化后的菌株按照煮沸法制備細(xì)菌DNA模板,，以大腸桿菌phoA基因的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定
• 毒力基因與耐藥性的關(guān)系：根據(jù)藥敏試驗的結(jié)果,，針對藥敏性較為普遍的抗生素的耐藥基因情況，找出其規(guī)律,，并研究獨立基因與耐藥性的關(guān)系,，然后采用多重PCR方法檢測耐藥基因，如4種氨基糖苷類耐藥基因aadA1,，aac2,，aac4，aphA3,；3種四環(huán)素類耐藥性基因tetA,，tetC以及tetM的流行情況
• 提取DNA及16s rDNA鑒定：提取細(xì)菌基因組DNA，并使用16s rRNA Bacterial Identification PCR kit的特異性引物進(jìn)行擴增,，后進(jìn)一步對PCR擴增的DNA克隆,、測序并開展序列分析
• 致病性試驗：參照A.E.Williams等方法，設(shè)置16組試驗組,，1組陰性對照,，實驗組每株菌攻毒4只小組，按0.2ul/只腹腔注射菌液濃度為1*10⁹ef/ml,，對照組4只小鼠注射等劑量的生理鹽水,，觀察發(fā)病及死亡情況，無菌采集死亡小鼠肝臟,、心臟進(jìn)行分離鑒定
• 雞胚致死試驗：將待測大腸桿菌分別劃板,，挑去平板上的單菌落，與LB液體培養(yǎng)基中37度搖床過夜培養(yǎng),，然后離心,，經(jīng)PBS洗2次，并用PBS懸液進(jìn)行倍比稀釋,，取0.1ml稀釋液經(jīng)尿囊腔接種12日齡SPF雞胚大約100-300CFU/只,，每組10只，同時取0.1ml稀釋液涂板,，做細(xì)菌計數(shù),，對照分兩組,，一組直射PBS，一組不注射,，計每日死亡數(shù),，質(zhì)4d，計胚胎致死率
• 病毒分離：收集病樣加入青霉素（終濃度1000U/ml）和鏈霉素（終濃度1000U/ml）,，于4℃作用4h以上,，取0.2ul接種于9-10日齡雞胚羊膜腔，37℃培養(yǎng)72h,，4℃過夜后收集羊水,，每份樣品接種3枚雞胚，采集的羊水用1%雞紅細(xì)胞進(jìn)行血凝試驗,，判斷病毒是否成功分離,，如果標(biāo)本呈陽性，采用血凝抑制試驗進(jìn)一步堅定,，標(biāo)本呈陰性則繼續(xù)自傳3代

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