Cytoskeleton,，Inc,。很高興為藥物篩選，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞骨架研究提供廣泛的試劑盒和產(chǎn)品,。我們專注于生產(chǎn)純化蛋白質(zhì)和易于使用的試劑盒,，以研究生物化學(xué)和細胞過程。我們的試劑盒可用于少量樣品,，用于基礎(chǔ)研究或小屏幕（Biochem Kits™）,，也可用于大屏幕的高通量樣品（CytoDYNAMIX Screens™）。

除了我們現(xiàn)有的產(chǎn)品,，我們還在產(chǎn)品線中為微管,，微管蛋白，運動蛋白,，小G蛋白效應(yīng)物,，GAP，GEF和其他幾種蛋白提供藥物篩選服務(wù),。

Binding Proteins

結(jié)合蛋白質(zhì)

· 概述

· 關(guān)于

· CITATIONS

· 常見問題解答

肌動蛋白與細胞中的多種蛋白質(zhì)相互作用
*,，F(xiàn)-和G-肌動蛋白與細胞中的多種蛋白質(zhì)相互作用（14）??。目前有超過150種已知的肌動蛋白結(jié)合蛋白（ABP）,，其占細胞蛋白的約25％,。ABP在肌動蛋白細胞骨架上賦予大量功能多樣性，其涉及諸如肌肉收縮,，唇形突破,，細胞運動，胞質(zhì)分裂和細胞質(zhì)流動的過程,。研究這些過程如何調(diào)節(jié)肌動蛋白絲功能和動力學(xué)是一個重要且不斷增長的研究領(lǐng)域,。

可以通過使用生物化學(xué)，遺傳學(xué)和免疫學(xué)方法分離和研究肌動蛋白結(jié)合蛋白,。因為存在超過50種類型的肌動蛋白結(jié)合蛋白,，所以用于鑒定它們的方法及其功能/活性也是多種多樣的。肌動蛋白親和柱通常用于親和純化ABP,，無論它們是F-或G-肌動蛋白結(jié)合,。可以通過利用芘肌動蛋白熒光的聚合增強來進行顯示潛在ABP影響肌動蛋白動力學(xué)的簡單測定（參見測量肌動蛋白聚合物部分）,。這種性質(zhì)的研究有助于鑒定新的肌動蛋白結(jié)合蛋白,。有幾篇值得一讀的關(guān)于識別和量化新肌動蛋白結(jié)合蛋白的可能方法的評論（15,16,17）?

問題1：哪種肌動蛋白結(jié)合蛋白（ABP）可用作F-肌動蛋白結(jié)合對照？ 

答案1：肌動蛋白結(jié)合蛋白α-輔肌動蛋白（Cat,。＃AT01）是一種F-肌動蛋白結(jié)合和交聯(lián)蛋白,，使其可用作F-肌動蛋白結(jié)合研究的對照。它的Kd是1μM,，這意味著在該濃度下發(fā)生50％結(jié)合,。因此，我們的目標(biāo)是使用 2μM的α-肌動蛋白作為結(jié)合測定中的陽性對照,。在結(jié)合反應(yīng)中,，2μM濃度的α-輔肌動蛋白相當(dāng)于0.23μg/μl。此外,，α-輔肌動蛋白對pH敏感,，其高親和力發(fā)生在pH 7.0,。

問題2：Cytoskeleton的肌球蛋白或重的meromyosin是否具有F-肌動蛋白活力？ 

答案2：遺憾的是,，我們不會出售運動級肌球蛋白或重肌紅蛋白用于肌動蛋白運動試驗,。我們發(fā)現(xiàn)質(zhì)量控制測試非常難以復(fù)制，因此我們無法充分確保試劑的質(zhì)量,。因此,，肌球蛋白（Cat。＃MY02和MY03）和重型meromyosin蛋白（Cat,。＃MH01）不推薦用于F-肌動蛋白運動測定,。已經(jīng)測試過這些試劑的客戶在運動方面沒有取得很好的成功，因此我們不建議購買樣品進行測試,。如果需要運動級肌動蛋白或重型meromyosin,，我們建議遵循原始方案（Kron和Spudich，1985）并在液氮中冷凍100μl等分試樣以確保穩(wěn)定性,。

    參考文獻：  SJ Kron和JA Spudich,，1985年。熒光肌動蛋白絲在固定在玻璃表面的肌球蛋白上移動,。PNAS，83,6272-6276,。

SiR-Actin Kit   SiR-肌動蛋白試劑盒

50 nmol SiR-Actin and 1 umol verapamil (Cat. # CY-SC001

SiR-肌動蛋白基于結(jié)合F-肌動蛋白的天然產(chǎn)物jasplakinolide,。SiR-肌動蛋白是熒光的，細胞可滲透的并且對F-肌動蛋白具有高度特異性,。Sir-actin在不需要遺傳操作或過表達的情況下對內(nèi)源性F-肌動蛋白進行染色,。它在遠紅色中的發(fā)射使光毒性和樣品自發(fā)熒光小化。SiR-肌動蛋白與GFP和/或m-cherry熒光蛋白相容,。它可以使用標(biāo)準(zhǔn)的Cy5濾波器進行成像,。SiR-肌動蛋白可用于活細胞和組織中的寬場，共焦,，SIM或STED成像,。探針數(shù)量允許50 - 200染色實驗。*

光學(xué)特性

λ _腹肌    652納米

λ _EM    674納米
ε _大  1.0·10 ⁵  摩爾^-1 ·厘米^-1

*基于以下條件：0.5-1ml染色溶液/染色實驗,，0.5-1μM探針濃度,。通過減少體積或探針濃度可以進一步增加染色實驗的數(shù)量。

Q1,。什么是STED顯微鏡以及它是如何工作的,？

A1。STED顯微鏡代表受刺激的發(fā)射消耗顯微鏡,。它是一種超分辨率顯微鏡,，它可以捕獲具有比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡更高分辨率的圖像,，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡受光的衍射約束。STED使用2個激光脈沖,，一個是激發(fā)熒光團的激發(fā)脈沖,，使其發(fā)熒光。被稱為STED脈沖的第二脈沖通過在未被激發(fā)的中心焦斑周圍的區(qū)域中的受激發(fā)射來去激發(fā)熒光團,，從而繼續(xù)發(fā)熒光,。這是通過將STED脈沖聚焦成環(huán)形，即所謂的甜甜圈來實現(xiàn)的,，其中中心焦點沒有STED激光脈沖,，賦予熒光區(qū)域高分辨率（圖1;參見參考文獻1了解更多信息）有關(guān)STED顯微鏡的詳細信息）。

圖1.人原代成纖維細胞中用SiR-微管蛋白標(biāo)記的微管的STED顯微圖像,。

Q2,。為什么SiR肌動蛋白（或微管蛋白）探針適用于STED顯微鏡檢查？

A2,。STED顯微鏡提供了在體內(nèi)研究納米極譜規(guī)模的細胞細節(jié)的能力,。為了利用這種超分辨率顯微鏡，人們必須能夠以高特異性選擇使用熒光探針檢查的區(qū)域,。此外,，熒光探針必須是明亮的，光穩(wěn)定的,，沒有或幾乎沒有光毒性,，被激發(fā)并在遠紅光譜中發(fā)射。另外,，如果探針用于活細胞成像（從而避免細胞固定時發(fā)生的固定偽影）,，則需要高細胞滲透性。SiR肌動蛋白和微管蛋白探針滿足所有這些要求,。簡而言之,，STED和SiR探針的組合允許亞細胞肌動蛋白和微管蛋白/微管結(jié)構(gòu)的的熒光可視化及其在活細胞中的物理表征（參見圖2）。2和參考 2）,。 

圖2.用SiR-肌動蛋白染色的培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元的STED圖像,。底部圖像是頂部圖像的一部分的特寫視圖，以清楚地顯示具有180nm周期性的肌動蛋白環(huán)（條紋）,。感謝Elisa D'Este,，MPI Biophysical Chemistry，Göttingen,。

Q3,。這些探頭的濾波器組是什么？

A3,。使用標(biāo)準(zhǔn)Cy5過濾器可視化SiR肌動蛋白和微管蛋白探針,。宜激發(fā)為650nm,，發(fā)射為670nm。我們推薦激發(fā)波長為630 + 20 nm,，發(fā)射波長為680 + 20 nm的濾光片（圖3）,。  

圖3. SiR探針的激發(fā)（藍色）和發(fā)射（紅色）光譜。

Q4,。為什么SiR探針與其他熒光團相比具有低背景,？

A4。SiR探針在近紅外/遠紅光譜范圍內(nèi)被激發(fā)并發(fā)光,，因此避免使用較短波長,，例如通常自發(fā)熒光的藍光和綠光，從而產(chǎn)生更高的背景信號,。SiR偶聯(lián)探針具有兩種物理狀態(tài)：1,。非熒光，封閉的關(guān)閉狀態(tài)（螺內(nèi)酯）和2.開放的,，高度熒光的開啟狀態(tài)（兩性離子）,。探針與其配體靶的結(jié)合有利于高度熒光的開放狀態(tài)，而游離的未結(jié)合的探針以閉合的非熒光狀態(tài)存在（圖4）,。熒光擴增從未結(jié)合狀態(tài)到結(jié)合狀態(tài)是100倍,。這導(dǎo)致高靈敏度的生物傳感器，其中大部分熒光僅在結(jié)合狀態(tài)下發(fā)生（參見參考文獻3和4）,。 

圖4.SiR衍生物存在于熒光兩性離子（開放）形式（左結(jié)構(gòu)）和非熒光螺（閉合）形式（右結(jié)構(gòu)）之間的平衡中,。

Q5：SiR探針在室溫下是否穩(wěn)定？

A5：是的,，探頭在室溫下穩(wěn)定幾天。但是,，它很大程度上取決于探針和溶劑,。因此，建議將所有探針或溶液儲存在-20°C,。

Q6：SiR-肌動蛋白和SiR-微管蛋白對細胞有毒嗎,？

A6：是的，高于某一閾值,，兩種探針都顯示出對細胞增殖和肌動蛋白或微管動力學(xué)改變的一些影響,。然而,，探針的毒性比其母體藥物低幾個數(shù)量級,。在HeLa細胞中,，肌動蛋白和微管動力學(xué)都不會在低于100 nM的濃度下發(fā)生改變,。在此濃度下,，SiR探針有效地標(biāo)記微管和F-肌動蛋白，從而捕獲高信噪比圖像,。

問題7：探針是否適用于固定細胞,？

A7：SiR-肌動蛋白探針可與PFA固定的細胞一起使用。SiR-肌動蛋白在PFA固定的細胞中標(biāo)記F-肌動蛋白與鬼筆環(huán)肽衍生物一樣有效,。SiR-微管蛋白僅在乙二醇 - 雙 - 琥珀酰亞胺基 - 琥珀酸酯（EGS） - 固定的細胞中標(biāo)記微管,。然而，觀察到PFA固定細胞的中心體微管的選擇性標(biāo)記,。SiR-肌動蛋白和SiR-微管蛋白不適用于甲醇固定的細胞,。

問題8：STORM可以成像SiR探針嗎？

A8：否 - 在STORM成像中通常使用的非常高的光強度下,，在活細胞上觀察到光毒性效應(yīng),。

Q9：哪些生物和組織被SiR探針染色？

A9：此列表僅描述已報告有效的細胞系,，組織或生物,。細胞系，組織或生物體的省略并不意味著SiR探針不能與特定細胞,，組織或生物體一起發(fā)揮作用,。

智人：U2OS，成纖維細胞,，HeLa,，HUVEC，MCF-10A,，HCT-116,，A549，紅細胞

Mus musculus：C2C12,，IA32,，骨骼肌，原代心肌細胞,，原代卵母細胞

褐家鼠：原代海馬神經(jīng)元,，原代皮層神經(jīng)元，NRK

Cercopithecus aethiops：COS-7

Mesocricetus auratus：BHK

果蠅（Drosophila melanogaster）：Notum上皮細胞,，S2

Didelphis marsupialis：OK細胞

Q10,。SiR探針在3D細胞培養(yǎng)中起作用嗎？

A10：是的,，探針能夠在3D生長環(huán)境中染色細胞,。

問題11：SiR熒光團的校正因子CF ₂₆₀和CF ₂₈₀是多少？

A11：CF ₂₆₀ = 0.116,，CF ₂₈₀  = 0.147

參考

1.地獄SW和Wichmann J. 1994. 通過受激發(fā)射破壞衍射分辨率極限：受激發(fā)射 - 耗盡熒光顯微鏡,。選擇。快報,。19,780-782,。

2. D'Este E.等。2015年STED納米顯微鏡揭示了皮質(zhì)細胞骨架的周期性的活神經(jīng)元的普及,。Cell Rep.10,1246-1251,。

3. Lukinavicius G.等。2013年的近紅外熒光的細胞蛋白的活細胞超分辨率顯微鏡,。納特,。化學(xué),。5,132-139,。

4. Lukinavicius G.等。2014. 用于細胞骨架的活細胞成像的熒光探針,。自然方法,。11,731-733。

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特色論文

“用于細胞骨架活細胞成像的熒光探針” ; G.Lukinavi?ius,，L.Reymond,，E。D'Este,，A,。Masharina，F(xiàn).Göttfert,，H,。Ta，A.Güther,，M,。Fournier，S,。Rizzo,，H。Waldmann,，C。Blaukopf,，C,。Sommer， DW Gerlich,，H.-D,。Arndt，SW Hell＆K。Johnsson; Nature Methods 11,731-733,2014,。

“STED納米顯微鏡揭示了活體神經(jīng)元中皮質(zhì)下細胞骨架周期性的普遍存在” ; E. D'Este,，D。Kamin,，F(xiàn).Göttfert,，A。El-Hady,，SW Hell; Cell Reports,，第10卷，第8期,，1246 - 1251,，2015年。

“近紅外熒光團用于細胞蛋白的活細胞超分辨率顯微鏡檢查” ; G.Lukinavi?ius,，K,。Umezawa，N,。Olivier,，A。Honigmann,，G,。Yang，T,。Plass,，V。Mueller,，L,。Reymond，IRCorrêaJr,，Z,。Luo，C,。Schultz,，EA Lemke，P,。Heppenstall ,，C。Eggeling,，S,。Manley＆K,。Johnsson; Nature Chemistry 5,132-139,2013。

“動態(tài)肌動蛋白絲控制人體紅細胞膜的機械行為” ; DS Gokhin,，RB Nowak,，JA Khoory，A,。de la Piedra,，IC Ghiran和VM Fowler; 摩爾。生物學(xué),。細胞; 2015年2月25日,。

“可裂解的溶細胞素 - 神經(jīng)肽Y生物結(jié)合物能夠?qū)崿F(xiàn)特定的藥物傳遞并證明細胞內(nèi)作用模式” ; VM Ahrens，KB Kostelnik,，R,。Rennert，D.Böhme,，S,。Kalkhof，D. Kosel,，L,。Weber，M,。von Bergen和AG Beck-Sickinger; J.控制,。發(fā)布; 209：170-178,2015。

“紅色Si-羅丹明藥物結(jié)合物能夠在GFP細胞中成像” ; E. Kim,，KS Yang,，RJ Giedt和R. Weissleder; 化學(xué)。Commun,。,，50,4504-4507,2014。

“微管的邊緣帶在視網(wǎng)膜雙極突觸末端轉(zhuǎn)運和組織線粒體” ; M. Graffe,，D,。Zenisek和J. Taraska; J. Gen Physiol。卷,。146 No.one：109-117,2015,。

應(yīng)用筆記

“用于活細胞STED顯微鏡的明亮染料” ; S. Pitsch，I.Köster,。

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