Cytoskeleton,，Inc,。很高興為藥物篩選,，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架研究提供廣泛的試劑盒和產(chǎn)品,。我們專注于生產(chǎn)純化蛋白質(zhì)和易于使用的試劑盒,，以研究生物化學(xué)和細(xì)胞過程。我們的試劑盒可用于少量樣品,，用于基礎(chǔ)研究或小屏幕（Biochem Kits™）,，也可用于大屏幕的高通量樣品（CytoDYNAMIX Screens™）。

除了我們現(xiàn)有的產(chǎn)品,，我們還在產(chǎn)品線中為微管,，微管蛋白，運(yùn)動(dòng)蛋白,，小G蛋白效應(yīng)物,，GAP，GEF和其他幾種蛋白提供藥物篩選服務(wù),。

Binding Proteins

結(jié)合蛋白質(zhì)

· 概述

· 關(guān)于

· CITATIONS

· 常見問題解答

肌動(dòng)蛋白與細(xì)胞中的多種蛋白質(zhì)相互作用
*,，F(xiàn)-和G-肌動(dòng)蛋白與細(xì)胞中的多種蛋白質(zhì)相互作用（14）??,。目前有超過150種已知的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（ABP），其占細(xì)胞蛋白的約25％,。ABP在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上賦予大量功能多樣性,，其涉及諸如肌肉收縮，唇形突破,，細(xì)胞運(yùn)動(dòng),，胞質(zhì)分裂和細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)的過程,。研究這些過程如何調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲功能和動(dòng)力學(xué)是一個(gè)重要且不斷增長的研究領(lǐng)域。

可以通過使用生物化學(xué),，遺傳學(xué)和免疫學(xué)方法分離和研究肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,。因?yàn)榇嬖诔^50種類型的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，所以用于鑒定它們的方法及其功能/活性也是多種多樣的,。肌動(dòng)蛋白親和柱通常用于親和純化ABP,，無論它們是F-或G-肌動(dòng)蛋白結(jié)合?？梢酝ㄟ^利用芘肌動(dòng)蛋白熒光的聚合增強(qiáng)來進(jìn)行顯示潛在ABP影響肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的簡單測定（參見測量肌動(dòng)蛋白聚合物部分）,。這種性質(zhì)的研究有助于鑒定新的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。有幾篇值得一讀的關(guān)于識(shí)別和量化新肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的可能方法的評(píng)論（15,16,17）?

問題1：哪種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（ABP）可用作F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合對(duì)照,？ 

答案1：肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白α-輔肌動(dòng)蛋白（Cat,。＃AT01）是一種F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合和交聯(lián)蛋白，使其可用作F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合研究的對(duì)照,。它的Kd是1μM,，這意味著在該濃度下發(fā)生50％結(jié)合,。因此,，我們的目標(biāo)是使用 2μM的α-肌動(dòng)蛋白作為結(jié)合測定中的陽性對(duì)照。在結(jié)合反應(yīng)中,，2μM濃度的α-輔肌動(dòng)蛋白相當(dāng)于0.23μg/μl,。此外，α-輔肌動(dòng)蛋白對(duì)pH敏感,，其高親和力發(fā)生在pH 7.0,。

問題2：Cytoskeleton的肌球蛋白或重的meromyosin是否具有F-肌動(dòng)蛋白活力？ 

答案2：遺憾的是,，我們不會(huì)出售運(yùn)動(dòng)級(jí)肌球蛋白或重肌紅蛋白用于肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)質(zhì)量控制測試非常難以復(fù)制,，因此我們無法充分確保試劑的質(zhì)量,。因此,，肌球蛋白（Cat,。＃MY02和MY03）和重型meromyosin蛋白（Cat,。＃MH01）不推薦用于F-肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)測定,。已經(jīng)測試過這些試劑的客戶在運(yùn)動(dòng)方面沒有取得很好的成功,，因此我們不建議購買樣品進(jìn)行測試。如果需要運(yùn)動(dòng)級(jí)肌動(dòng)蛋白或重型meromyosin,，我們建議遵循原始方案（Kron和Spudich,，1985）并在液氮中冷凍100μl等分試樣以確保穩(wěn)定性。

    參考文獻(xiàn)：  SJ Kron和JA Spudich,，1985年,。熒光肌動(dòng)蛋白絲在固定在玻璃表面的肌球蛋白上移動(dòng)。PNAS,，83,6272-6276,。

SiR-Actin Kit   SiR-肌動(dòng)蛋白試劑盒

50 nmol SiR-Actin and 1 umol verapamil (Cat. # CY-SC001

SiR-肌動(dòng)蛋白基于結(jié)合F-肌動(dòng)蛋白的天然產(chǎn)物jasplakinolide,。SiR-肌動(dòng)蛋白是熒光的,，細(xì)胞可滲透的并且對(duì)F-肌動(dòng)蛋白具有高度特異性。Sir-actin在不需要遺傳操作或過表達(dá)的情況下對(duì)內(nèi)源性F-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行染色,。它在遠(yuǎn)紅色中的發(fā)射使光毒性和樣品自發(fā)熒光小化,。SiR-肌動(dòng)蛋白與GFP和/或m-cherry熒光蛋白相容。它可以使用標(biāo)準(zhǔn)的Cy5濾波器進(jìn)行成像,。SiR-肌動(dòng)蛋白可用于活細(xì)胞和組織中的寬場,，共焦，SIM或STED成像,。探針數(shù)量允許50 - 200染色實(shí)驗(yàn),。*

光學(xué)特性

λ _腹肌    652納米

λ _EM    674納米
ε _大  1.0·10 ⁵  摩爾^-1 ·厘米^-1

*基于以下條件：0.5-1ml染色溶液/染色實(shí)驗(yàn)，0.5-1μM探針濃度,。通過減少體積或探針濃度可以進(jìn)一步增加染色實(shí)驗(yàn)的數(shù)量,。

Q1。什么是STED顯微鏡以及它是如何工作的,？

A1,。STED顯微鏡代表受刺激的發(fā)射消耗顯微鏡。它是一種超分辨率顯微鏡,，它可以捕獲具有比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡更高分辨率的圖像,，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡受光的衍射約束。STED使用2個(gè)激光脈沖,，一個(gè)是激發(fā)熒光團(tuán)的激發(fā)脈沖，使其發(fā)熒光,。被稱為STED脈沖的第二脈沖通過在未被激發(fā)的中心焦斑周圍的區(qū)域中的受激發(fā)射來去激發(fā)熒光團(tuán),，從而繼續(xù)發(fā)熒光。這是通過將STED脈沖聚焦成環(huán)形,，即所謂的甜甜圈來實(shí)現(xiàn)的,，其中中心焦點(diǎn)沒有STED激光脈沖,，賦予熒光區(qū)域高分辨率（圖1;參見參考文獻(xiàn)1了解更多信息）有關(guān)STED顯微鏡的詳細(xì)信息）。

圖1.人原代成纖維細(xì)胞中用SiR-微管蛋白標(biāo)記的微管的STED顯微圖像,。

Q2,。為什么SiR肌動(dòng)蛋白（或微管蛋白）探針適用于STED顯微鏡檢查？

A2,。STED顯微鏡提供了在體內(nèi)研究納米極譜規(guī)模的細(xì)胞細(xì)節(jié)的能力,。為了利用這種超分辨率顯微鏡，人們必須能夠以高特異性選擇使用熒光探針檢查的區(qū)域,。此外,，熒光探針必須是明亮的，光穩(wěn)定的,，沒有或幾乎沒有光毒性,，被激發(fā)并在遠(yuǎn)紅光譜中發(fā)射。另外,，如果探針用于活細(xì)胞成像（從而避免細(xì)胞固定時(shí)發(fā)生的固定偽影）,，則需要高細(xì)胞滲透性。SiR肌動(dòng)蛋白和微管蛋白探針滿足所有這些要求,。簡而言之,，STED和SiR探針的組合允許亞細(xì)胞肌動(dòng)蛋白和微管蛋白/微管結(jié)構(gòu)的的熒光可視化及其在活細(xì)胞中的物理表征（參見圖2）。2和參考 2）,。 

圖2.用SiR-肌動(dòng)蛋白染色的培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元的STED圖像,。底部圖像是頂部圖像的一部分的特寫視圖，以清楚地顯示具有180nm周期性的肌動(dòng)蛋白環(huán)（條紋）,。感謝Elisa D'Este,，MPI Biophysical Chemistry，Göttingen,。

Q3,。這些探頭的濾波器組是什么？

A3,。使用標(biāo)準(zhǔn)Cy5過濾器可視化SiR肌動(dòng)蛋白和微管蛋白探針,。宜激發(fā)為650nm，發(fā)射為670nm,。我們推薦激發(fā)波長為630 + 20 nm,，發(fā)射波長為680 + 20 nm的濾光片（圖3）。  

圖3. SiR探針的激發(fā)（藍(lán)色）和發(fā)射（紅色）光譜,。

Q4,。為什么SiR探針與其他熒光團(tuán)相比具有低背景？

A4。SiR探針在近紅外/遠(yuǎn)紅光譜范圍內(nèi)被激發(fā)并發(fā)光,，因此避免使用較短波長,，例如通常自發(fā)熒光的藍(lán)光和綠光，從而產(chǎn)生更高的背景信號(hào),。SiR偶聯(lián)探針具有兩種物理狀態(tài)：1,。非熒光，封閉的關(guān)閉狀態(tài)（螺內(nèi)酯）和2.開放的,，高度熒光的開啟狀態(tài)（兩性離子）,。探針與其配體靶的結(jié)合有利于高度熒光的開放狀態(tài)，而游離的未結(jié)合的探針以閉合的非熒光狀態(tài)存在（圖4）,。熒光擴(kuò)增從未結(jié)合狀態(tài)到結(jié)合狀態(tài)是100倍,。這導(dǎo)致高靈敏度的生物傳感器，其中大部分熒光僅在結(jié)合狀態(tài)下發(fā)生（參見參考文獻(xiàn)3和4）,。 

圖4.SiR衍生物存在于熒光兩性離子（開放）形式（左結(jié)構(gòu)）和非熒光螺（閉合）形式（右結(jié)構(gòu)）之間的平衡中,。

Q5：SiR探針在室溫下是否穩(wěn)定？

A5：是的,，探頭在室溫下穩(wěn)定幾天,。但是，它很大程度上取決于探針和溶劑,。因此,，建議將所有探針或溶液儲(chǔ)存在-20°C。

Q6：SiR-肌動(dòng)蛋白和SiR-微管蛋白對(duì)細(xì)胞有毒嗎,？

A6：是的,，高于某一閾值，兩種探針都顯示出對(duì)細(xì)胞增殖和肌動(dòng)蛋白或微管動(dòng)力學(xué)改變的一些影響,。然而,，探針的毒性比其母體藥物低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。在HeLa細(xì)胞中,，肌動(dòng)蛋白和微管動(dòng)力學(xué)都不會(huì)在低于100 nM的濃度下發(fā)生改變,。在此濃度下，SiR探針有效地標(biāo)記微管和F-肌動(dòng)蛋白,，從而捕獲高信噪比圖像,。

問題7：探針是否適用于固定細(xì)胞？

A7：SiR-肌動(dòng)蛋白探針可與PFA固定的細(xì)胞一起使用,。SiR-肌動(dòng)蛋白在PFA固定的細(xì)胞中標(biāo)記F-肌動(dòng)蛋白與鬼筆環(huán)肽衍生物一樣有效,。SiR-微管蛋白僅在乙二醇 - 雙 - 琥珀酰亞胺基 - 琥珀酸酯（EGS） - 固定的細(xì)胞中標(biāo)記微管。然而,，觀察到PFA固定細(xì)胞的中心體微管的選擇性標(biāo)記,。SiR-肌動(dòng)蛋白和SiR-微管蛋白不適用于甲醇固定的細(xì)胞。

問題8：STORM可以成像SiR探針嗎？

A8：否 - 在STORM成像中通常使用的非常高的光強(qiáng)度下,，在活細(xì)胞上觀察到光毒性效應(yīng)。

Q9：哪些生物和組織被SiR探針染色,？

A9：此列表僅描述已報(bào)告有效的細(xì)胞系,，組織或生物。細(xì)胞系,，組織或生物體的省略并不意味著SiR探針不能與特定細(xì)胞,，組織或生物體一起發(fā)揮作用。

智人：U2OS,，成纖維細(xì)胞,，HeLa，HUVEC,，MCF-10A,，HCT-116，A549,，紅細(xì)胞

Mus musculus：C2C12,，IA32，骨骼肌,，原代心肌細(xì)胞,，原代卵母細(xì)胞

褐家鼠：原代海馬神經(jīng)元，原代皮層神經(jīng)元,，NRK

Cercopithecus aethiops：COS-7

Mesocricetus auratus：BHK

果蠅（Drosophila melanogaster）：Notum上皮細(xì)胞,，S2

Didelphis marsupialis：OK細(xì)胞

Q10。SiR探針在3D細(xì)胞培養(yǎng)中起作用嗎,？

A10：是的,，探針能夠在3D生長環(huán)境中染色細(xì)胞。

問題11：SiR熒光團(tuán)的校正因子CF ₂₆₀和CF ₂₈₀是多少,？

A11：CF ₂₆₀ = 0.116,，CF ₂₈₀  = 0.147

參考

1.地獄SW和Wichmann J. 1994. 通過受激發(fā)射破壞衍射分辨率極限：受激發(fā)射 - 耗盡熒光顯微鏡。選擇,?？靾?bào)。19,780-782,。

2. D'Este E.等,。2015年STED納米顯微鏡揭示了皮質(zhì)細(xì)胞骨架的周期性的活神經(jīng)元的普及。Cell Rep.10,1246-1251,。

3. Lukinavicius G.等,。2013年的近紅外熒光的細(xì)胞蛋白的活細(xì)胞超分辨率顯微鏡。納特?；瘜W(xué),。5,132-139。

4. Lukinavicius G.等,。2014. 用于細(xì)胞骨架的活細(xì)胞成像的熒光探針,。自然方法。11,731-733,。

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特色論文

“用于細(xì)胞骨架活細(xì)胞成像的熒光探針” ; G.Lukinavi?ius,，L.Reymond，E,。D'Este,，A。Masharina,，F(xiàn).Göttfert,，H。Ta,，A.Güther,，M。Fournier,，S,。Rizzo，H,。Waldmann,，C。Blaukopf,，C,。Sommer， DW Gerlich,，H.-D,。Arndt，SW Hell＆K,。Johnsson; Nature Methods 11,731-733,2014,。

“STED納米顯微鏡揭示了活體神經(jīng)元中皮質(zhì)下細(xì)胞骨架周期性的普遍存在” ; E. D'Este，D,。Kamin,，F(xiàn).Göttfert，A,。El-Hady,，SW Hell; Cell Reports,，第10卷，第8期,，1246 - 1251,，2015年。

“近紅外熒光團(tuán)用于細(xì)胞蛋白的活細(xì)胞超分辨率顯微鏡檢查” ; G.Lukinavi?ius,，K,。Umezawa，N,。Olivier，A,。Honigmann,，G。Yang,，T,。Plass，V,。Mueller,，L。Reymond,，IRCorrêaJr,，Z。Luo,，C,。Schultz，EA Lemke,，P,。Heppenstall ，C,。Eggeling,，S。Manley＆K,。Johnsson; Nature Chemistry 5,132-139,2013,。

“動(dòng)態(tài)肌動(dòng)蛋白絲控制人體紅細(xì)胞膜的機(jī)械行為” ; DS Gokhin，RB Nowak,，JA Khoory,，A。de la Piedra,，IC Ghiran和VM Fowler; 摩爾,。生物學(xué),。細(xì)胞; 2015年2月25日。

“可裂解的溶細(xì)胞素 - 神經(jīng)肽Y生物結(jié)合物能夠?qū)崿F(xiàn)特定的藥物傳遞并證明細(xì)胞內(nèi)作用模式” ; VM Ahrens,，KB Kostelnik,，R。Rennert,，D.Böhme,，S。Kalkhof,，D. Kosel,，L。Weber,，M,。von Bergen和AG Beck-Sickinger; J.控制。發(fā)布; 209：170-178,2015,。

“紅色Si-羅丹明藥物結(jié)合物能夠在GFP細(xì)胞中成像” ; E. Kim,，KS Yang，RJ Giedt和R. Weissleder; 化學(xué),。Commun,。，50,4504-4507,2014,。

“微管的邊緣帶在視網(wǎng)膜雙極突觸末端轉(zhuǎn)運(yùn)和組織線粒體” ; M. Graffe,，D。Zenisek和J. Taraska; J. Gen Physiol,。卷,。146 No.one：109-117,2015。

應(yīng)用筆記

“用于活細(xì)胞STED顯微鏡的明亮染料” ; S. Pitsch,，I.Köster,。

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