Cytoskeleton SiR-Actin Kit說明書

最近更新時間：2018-8-17

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Cytoskeleton,，Inc,。很高興為藥物篩選,，信號轉導和細胞骨架研究提供廣泛的試劑盒和產品,。我們專注于生產純化蛋白質和易于使用的試劑盒，以研究生物化學和細胞過程,。我們的試劑盒可用于少量樣品,，用于基礎研究或小屏幕（Biochem Kits™），也可用于大屏幕的高通量樣品（CytoDYNAMIX Screens™）,。

除了我們現(xiàn)有的產品,，我們還在產品線中為微管，微管蛋白,，運動蛋白,，小G蛋白效應物，GAP,，GEF和其他幾種蛋白提供藥物篩選服務,。

Binding Proteins

結合蛋白質

· 概述

· 關于

· CITATIONS

· 常見問題解答

肌動蛋白與細胞中的多種蛋白質相互作用
*,，F(xiàn)-和G-肌動蛋白與細胞中的多種蛋白質相互作用（14）??,。目前有超過150種已知的肌動蛋白結合蛋白（ABP），其占細胞蛋白的約25％,。ABP在肌動蛋白細胞骨架上賦予大量功能多樣性,，其涉及諸如肌肉收縮，唇形突破,，細胞運動，胞質分裂和細胞質流動的過程,。研究這些過程如何調節(jié)肌動蛋白絲功能和動力學是一個重要且不斷增長的研究領域。

可以通過使用生物化學,，遺傳學和免疫學方法分離和研究肌動蛋白結合蛋白,。因為存在超過50種類型的肌動蛋白結合蛋白，所以用于鑒定它們的方法及其功能/活性也是多種多樣的,。肌動蛋白親和柱通常用于親和純化ABP，無論它們是F-或G-肌動蛋白結合,?？梢酝ㄟ^利用芘肌動蛋白熒光的聚合增強來進行顯示潛在ABP影響肌動蛋白動力學的簡單測定（參見測量肌動蛋白聚合物部分）。這種性質的研究有助于鑒定新的肌動蛋白結合蛋白,。有幾篇值得一讀的關于識別和量化新肌動蛋白結合蛋白的可能方法的評論（15,16,17）?

問題1：哪種肌動蛋白結合蛋白（ABP）可用作F-肌動蛋白結合對照,？ 

答案1：肌動蛋白結合蛋白α-輔肌動蛋白（Cat,。＃AT01）是一種F-肌動蛋白結合和交聯(lián)蛋白,，使其可用作F-肌動蛋白結合研究的對照。它的Kd是1μM,，這意味著在該濃度下發(fā)生50％結合,。因此，我們的目標是使用 2μM的α-肌動蛋白作為結合測定中的陽性對照,。在結合反應中,，2μM濃度的α-輔肌動蛋白相當于0.23μg/μl。此外,，α-輔肌動蛋白對pH敏感,，其高親和力發(fā)生在pH 7.0。

問題2：Cytoskeleton的肌球蛋白或重的meromyosin是否具有F-肌動蛋白活力,？ 

答案2：遺憾的是,，我們不會出售運動級肌球蛋白或重肌紅蛋白用于肌動蛋白運動試驗,。我們發(fā)現(xiàn)質量控制測試非常難以復制，因此我們無法充分確保試劑的質量,。因此,，肌球蛋白（Cat。＃MY02和MY03）和重型meromyosin蛋白（Cat,。＃MH01）不推薦用于F-肌動蛋白運動測定,。已經測試過這些試劑的客戶在運動方面沒有取得很好的成功,，因此我們不建議購買樣品進行測試,。如果需要運動級肌動蛋白或重型meromyosin，我們建議遵循原始方案（Kron和Spudich,，1985）并在液氮中冷凍100μl等分試樣以確保穩(wěn)定性,。

    參考文獻：  SJ Kron和JA Spudich，1985年,。熒光肌動蛋白絲在固定在玻璃表面的肌球蛋白上移動,。PNAS，83,6272-6276,。

SiR-Actin Kit   SiR-肌動蛋白試劑盒

50 nmol SiR-Actin and 1 umol verapamil (Cat. # CY-SC001

SiR-肌動蛋白基于結合F-肌動蛋白的天然產物jasplakinolide,。SiR-肌動蛋白是熒光的，細胞可滲透的并且對F-肌動蛋白具有高度特異性,。Sir-actin在不需要遺傳操作或過表達的情況下對內源性F-肌動蛋白進行染色,。它在遠紅色中的發(fā)射使光毒性和樣品自發(fā)熒光小化。SiR-肌動蛋白與GFP和/或m-cherry熒光蛋白相容,。它可以使用標準的Cy5濾波器進行成像,。SiR-肌動蛋白可用于活細胞和組織中的寬場，共焦,，SIM或STED成像,。探針數(shù)量允許50 - 200染色實驗。*

光學特性

λ _腹肌    652納米

λ _EM    674納米
ε _大  1.0·10 ⁵  摩爾^-1 ·厘米^-1

*基于以下條件：0.5-1ml染色溶液/染色實驗,，0.5-1μM探針濃度,。通過減少體積或探針濃度可以進一步增加染色實驗的數(shù)量。

Q1,。什么是STED顯微鏡以及它是如何工作的,？

A1。STED顯微鏡代表受刺激的發(fā)射消耗顯微鏡,。它是一種超分辨率顯微鏡,，它可以捕獲具有比傳統(tǒng)光學顯微鏡更高分辨率的圖像，傳統(tǒng)光學顯微鏡受光的衍射約束,。STED使用2個激光脈沖,，一個是激發(fā)熒光團的激發(fā)脈沖,，使其發(fā)熒光。被稱為STED脈沖的第二脈沖通過在未被激發(fā)的中心焦斑周圍的區(qū)域中的受激發(fā)射來去激發(fā)熒光團,，從而繼續(xù)發(fā)熒光,。這是通過將STED脈沖聚焦成環(huán)形，即所謂的甜甜圈來實現(xiàn)的,，其中中心焦點沒有STED激光脈沖,，賦予熒光區(qū)域高分辨率（圖1;參見參考文獻1了解更多信息）有關STED顯微鏡的詳細信息）。

圖1.人原代成纖維細胞中用SiR-微管蛋白標記的微管的STED顯微圖像,。

Q2,。為什么SiR肌動蛋白（或微管蛋白）探針適用于STED顯微鏡檢查？

A2,。STED顯微鏡提供了在體內研究納米極譜規(guī)模的細胞細節(jié)的能力,。為了利用這種超分辨率顯微鏡，人們必須能夠以高特異性選擇使用熒光探針檢查的區(qū)域,。此外,，熒光探針必須是明亮的，光穩(wěn)定的,，沒有或幾乎沒有光毒性,，被激發(fā)并在遠紅光譜中發(fā)射。另外,，如果探針用于活細胞成像（從而避免細胞固定時發(fā)生的固定偽影）,，則需要高細胞滲透性。SiR肌動蛋白和微管蛋白探針滿足所有這些要求,。簡而言之,，STED和SiR探針的組合允許亞細胞肌動蛋白和微管蛋白/微管結構的的熒光可視化及其在活細胞中的物理表征（參見圖2）。2和參考 2）,。 

圖2.用SiR-肌動蛋白染色的培養(yǎng)的大鼠海馬神經元的STED圖像,。底部圖像是頂部圖像的一部分的特寫視圖，以清楚地顯示具有180nm周期性的肌動蛋白環(huán)（條紋）,。感謝Elisa D'Este,，MPI Biophysical Chemistry，Göttingen,。

Q3,。這些探頭的濾波器組是什么？

A3,。使用標準Cy5過濾器可視化SiR肌動蛋白和微管蛋白探針,。宜激發(fā)為650nm，發(fā)射為670nm。我們推薦激發(fā)波長為630 + 20 nm,，發(fā)射波長為680 + 20 nm的濾光片（圖3）,。  

圖3. SiR探針的激發(fā)（藍色）和發(fā)射（紅色）光譜。

Q4,。為什么SiR探針與其他熒光團相比具有低背景,？

A4。SiR探針在近紅外/遠紅光譜范圍內被激發(fā)并發(fā)光,，因此避免使用較短波長,，例如通常自發(fā)熒光的藍光和綠光，從而產生更高的背景信號,。SiR偶聯(lián)探針具有兩種物理狀態(tài)：1,。非熒光，封閉的關閉狀態(tài)（螺內酯）和2.開放的,，高度熒光的開啟狀態(tài)（兩性離子）,。探針與其配體靶的結合有利于高度熒光的開放狀態(tài),，而游離的未結合的探針以閉合的非熒光狀態(tài)存在（圖4）,。熒光擴增從未結合狀態(tài)到結合狀態(tài)是100倍。這導致高靈敏度的生物傳感器,，其中大部分熒光僅在結合狀態(tài)下發(fā)生（參見參考文獻3和4）,。 

圖4.SiR衍生物存在于熒光兩性離子（開放）形式（左結構）和非熒光螺（閉合）形式（右結構）之間的平衡中。

Q5：SiR探針在室溫下是否穩(wěn)定,？

A5：是的,，探頭在室溫下穩(wěn)定幾天。但是,，它很大程度上取決于探針和溶劑,。因此，建議將所有探針或溶液儲存在-20°C,。

Q6：SiR-肌動蛋白和SiR-微管蛋白對細胞有毒嗎,？

A6：是的，高于某一閾值,，兩種探針都顯示出對細胞增殖和肌動蛋白或微管動力學改變的一些影響,。然而，探針的毒性比其母體藥物低幾個數(shù)量級,。在HeLa細胞中,，肌動蛋白和微管動力學都不會在低于100 nM的濃度下發(fā)生改變。在此濃度下,，SiR探針有效地標記微管和F-肌動蛋白,，從而捕獲高信噪比圖像。

問題7：探針是否適用于固定細胞？

A7：SiR-肌動蛋白探針可與PFA固定的細胞一起使用,。SiR-肌動蛋白在PFA固定的細胞中標記F-肌動蛋白與鬼筆環(huán)肽衍生物一樣有效,。SiR-微管蛋白僅在乙二醇 - 雙 - 琥珀酰亞胺基 - 琥珀酸酯（EGS） - 固定的細胞中標記微管。然而,，觀察到PFA固定細胞的中心體微管的選擇性標記,。SiR-肌動蛋白和SiR-微管蛋白不適用于甲醇固定的細胞。

問題8：STORM可以成像SiR探針嗎,？

A8：否 - 在STORM成像中通常使用的非常高的光強度下,，在活細胞上觀察到光毒性效應。

Q9：哪些生物和組織被SiR探針染色,？

A9：此列表僅描述已報告有效的細胞系,，組織或生物。細胞系,，組織或生物體的省略并不意味著SiR探針不能與特定細胞,，組織或生物體一起發(fā)揮作用。

智人：U2OS,，成纖維細胞,，HeLa，HUVEC,，MCF-10A,，HCT-116，A549,，紅細胞

Mus musculus：C2C12,，IA32，骨骼肌,，原代心肌細胞,，原代卵母細胞

褐家鼠：原代海馬神經元，原代皮層神經元,，NRK

Cercopithecus aethiops：COS-7

Mesocricetus auratus：BHK

果蠅（Drosophila melanogaster）：Notum上皮細胞,，S2

Didelphis marsupialis：OK細胞

Q10。SiR探針在3D細胞培養(yǎng)中起作用嗎,？

A10：是的,，探針能夠在3D生長環(huán)境中染色細胞。

問題11：SiR熒光團的校正因子CF ₂₆₀和CF ₂₈₀是多少,？

A11：CF ₂₆₀ = 0.116,，CF ₂₈₀  = 0.147

參考

1.地獄SW和Wichmann J. 1994. 通過受激發(fā)射破壞衍射分辨率極限：受激發(fā)射 - 耗盡熒光顯微鏡。選擇,?？靾蟆?9,780-782。

2. D'Este E.等,。2015年STED納米顯微鏡揭示了皮質細胞骨架的周期性的活神經元的普及,。Cell Rep.10,1246-1251。

3. Lukinavicius G.等,。2013年的近紅外熒光的細胞蛋白的活細胞超分辨率顯微鏡,。納特?；瘜W,。5,132-139。

4. Lukinavicius G.等,。2014. 用于細胞骨架的活細胞成像的熒光探針,。自然方法。11,731-733,。

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特色論文

“用于細胞骨架活細胞成像的熒光探針” ; G.Lukinavi?ius,，L.Reymond，E,。D'Este,，A。Masharina,，F(xiàn).Göttfert,，H,。Ta,，A.Güther，M,。Fournier,，S。Rizzo,，H,。Waldmann，C,。Blaukopf,，C。Sommer,， DW Gerlich,，H.-D。Arndt,，SW Hell＆K,。Johnsson; Nature Methods 11,731-733,2014。

“STED納米顯微鏡揭示了活體神經元中皮質下細胞骨架周期性的普遍存在” ; E. D'Este，D,。Kamin,，F(xiàn).Göttfert，A,。El-Hady,，SW Hell; Cell Reports，第10卷,，第8期,，1246 - 1251，2015年,。

“近紅外熒光團用于細胞蛋白的活細胞超分辨率顯微鏡檢查” ; G.Lukinavi?ius,，K。Umezawa,，N,。Olivier，A,。Honigmann,，G。Yang,，T,。Plass，V,。Mueller,，L。Reymond,，IRCorrêaJr,，Z。Luo,，C,。Schultz，EA Lemke,，P,。Heppenstall ，C,。Eggeling,，S。Manley＆K,。Johnsson; Nature Chemistry 5,132-139,2013,。

“動態(tài)肌動蛋白絲控制人體紅細胞膜的機械行為” ; DS Gokhin,，RB Nowak，JA Khoory,，A,。de la Piedra，IC Ghiran和VM Fowler; 摩爾,。生物學,。細胞; 2015年2月25日。

“可裂解的溶細胞素 - 神經肽Y生物結合物能夠實現(xiàn)特定的藥物傳遞并證明細胞內作用模式” ; VM Ahrens,，KB Kostelnik,，R。Rennert,，D.Böhme,，S。Kalkhof,，D. Kosel,，L。Weber,，M,。von Bergen和AG Beck-Sickinger; J.控制。發(fā)布; 209：170-178,2015,。

“紅色Si-羅丹明藥物結合物能夠在GFP細胞中成像” ; E. Kim,，KS Yang，RJ Giedt和R. Weissleder; 化學,。Commun,。，50,4504-4507,2014,。

“微管的邊緣帶在視網(wǎng)膜雙極突觸末端轉運和組織線粒體” ; M. Graffe,，D。Zenisek和J. Taraska; J. Gen Physiol,。卷。146 No.one：109-117,2015,。

應用筆記

“用于活細胞STED顯微鏡的明亮染料” ; S. Pitsch,，I.Köster。

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