myPOLS Biotec是一家來(lái)自康斯坦茨大學(xué)的生物技術(shù)公司,，來(lái)自Andreas Marx教授的研究小組,。憑借我們?cè)诟咄緿NA聚合酶設(shè)計(jì)方面的專業(yè)知識(shí)，我們?yōu)槟膽?yīng)用定制酶。

myPOLS Biotec正在開(kāi)發(fā)新一代的DNA聚合酶

用于和可靠的應(yīng)用,，例如個(gè)性化醫(yī)療，病原體檢測(cè),，DNA和RNA診斷,，法醫(yī)學(xué)等等。

我們的研發(fā)活動(dòng)包括：

• 改進(jìn)的DNA聚合酶用于SNP檢測(cè)和甲基化特異性PCR,。
• 病原體檢測(cè)分析,，例如用于流感和諾如病毒診斷。
• 具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶,。
• 抑制劑抗性聚合酶,，用于從樣品中直接PCR，如全血,，唾液,，細(xì)菌，細(xì)胞 - 顆粒,，植物等,。 

后但并非不重要：我們所有的酶和混合物都是在康斯坦茨內(nèi)部生產(chǎn)的，并經(jīng)過(guò)常規(guī)測(cè)試，符合高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),。

VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix

該混合物專門針對(duì)直接從電池應(yīng)用進(jìn)行了優(yōu)化,。

省略耗時(shí)且昂貴的RNA純化。VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix使您能夠直接從細(xì)胞懸液或細(xì)胞裂解液中定量和檢測(cè)RNA,，無(wú)需純化步驟,。只需將細(xì)胞分離，將細(xì)胞懸浮液直接添加到RT-PCR反應(yīng)混合物中,，放入實(shí)時(shí)儀器中,，然后啟動(dòng)。

任選地,，使用裂解緩沖液直接在孔或燒瓶中裂解細(xì)胞,，簡(jiǎn)單地旋轉(zhuǎn)并將上清液直接加入到RT-PCR混合物中。 - 準(zhǔn)備好了,。

裂解物也可以冷凍并儲(chǔ)存在-20℃,。

應(yīng)用

• 使用引物/探針或?qū)崟r(shí)PCR染料直接從細(xì)胞RNA檢測(cè)和定量
• 每個(gè)樣品100-10.000個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)分析。
• 適用于多種細(xì)胞類型

VolcanoCell2G可以直接從細(xì)胞中進(jìn)行靈敏的RNA檢測(cè)：  

反應(yīng)設(shè)置

將所有組件保存在冰上,。
在使用前仔細(xì)旋轉(zhuǎn)并混合所有溶液,。

*請(qǐng)注意，Volcano RT-PCR混合物是從DNA和RNA模板擴(kuò)增的,，因此必須使用僅與外顯子 - 外顯子連接結(jié)合的RNA選擇性引物,。

**建議的細(xì)胞數(shù)是懸浮在無(wú)核酸酶水或1x VolcanoCell2G裂解緩沖液中的10-10,000個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞懸浮液應(yīng)按照隨附手冊(cè)的“方法”部分的建議進(jìn)行新鮮制備,。

***細(xì)胞培養(yǎng)的模板可直接通過(guò)在無(wú)核酸酶水中稀釋細(xì)胞沉淀（產(chǎn)品手冊(cè)的METHODS部分中的方案1）或通過(guò)用1x VolcanoCell2G裂解緩沖液裂解孔或管中的細(xì)胞來(lái)制備（方案2）在產(chǎn)品手冊(cè)的METHODS部分中,，當(dāng)需要從不同的孔（例如：在微量滴定板上）制備RT-PCR反應(yīng)時(shí)，這對(duì)于高通量測(cè)定可能更有用,。

典型的0步RT-PCR方案（不需要等溫逆轉(zhuǎn)錄步驟）

*通常,，退火溫度比所用引物的計(jì)算熔融溫度低約3-5℃。通過(guò)運(yùn)行溫度梯度理想地建立新的PCR,，以便找到每個(gè)引物對(duì)的宜退火/延伸溫度,。還可以應(yīng)用三步協(xié)議，具有單獨(dú)的退火和延伸步驟,。

詳細(xì)的產(chǎn)品說(shuō)明

該試劑盒包含一種工程化，極熱穩(wěn)定的逆轉(zhuǎn)錄酶和組合的DNA聚合酶,，包括一個(gè)特別優(yōu)化的緩沖系統(tǒng),，只需要少量細(xì)胞（100到10,000個(gè)細(xì)胞）。套件中還包含單獨(dú)的裂解緩沖液,。

所包含的Volcano2G DNA聚合酶通過(guò)多代定向人工進(jìn)化而設(shè)計(jì),，并且在95℃下的半衰期> 40分鐘,。它直接從細(xì)胞懸浮液或裂解物中促進(jìn)“零步”RT-PCR，無(wú)需等溫逆轉(zhuǎn)錄步驟,。

VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix包含所有標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)循環(huán)儀器中成功可靠的RT-PCR所需的所有組分,，并且與常見(jiàn)的RT-PCR檢測(cè)方法兼容，如熒光實(shí)時(shí)PCR染料或熒光探針,。

推薦的擴(kuò)增子大小應(yīng)在60-300 bp之間,。?

請(qǐng)注意，必須使用跨越外顯子 - 外顯子連接的引物,，以限制僅對(duì)mRNA靶標(biāo)的擴(kuò)增,。

通過(guò)避免昂貴，耗時(shí)的細(xì)胞裂解或RNA純化,，VolcanoCell試劑盒是高通量應(yīng)用,，RNAi敲除或基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)的理想選擇。預(yù)先準(zhǔn)備好的2x混合物可確?？芍貜?fù)的RT-PCR結(jié)果,，顯著縮短設(shè)置時(shí)間和移液錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)。只需添加引物和模板,。用包含的裂解緩沖液可以容易地制備細(xì)胞裂解物,。但是，擴(kuò)增子的大小宜在60-300 bp之間,！

產(chǎn)品的成分/含量

VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix含有工程DNA聚合酶,，在具有dNTP的應(yīng)用優(yōu)化緩沖系統(tǒng)中具有逆轉(zhuǎn)錄活性。還包括單獨(dú)的裂解緩沖液,。

質(zhì)量控制

RT-PCR活性：測(cè)試VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix的成功RT-PCR性能,。在實(shí)時(shí)PCR循環(huán)儀中從人總RNA提取物擴(kuò)增151bp片段（HPRT1 mRNA），并將其顯示為單一擴(kuò)增產(chǎn)物,。

DNA聚合酶活性：已經(jīng)使用人工DNA模板和DNA引物監(jiān)測(cè)Volcano2G聚合酶活性并將其調(diào)整為特定的DNA聚合酶活性,。
通過(guò)蛋白質(zhì)特異性染色確定酶濃度。有關(guān)批次特定濃度,，請(qǐng)通過(guò)[email protected]查詢更多信息,。

存儲(chǔ)

本產(chǎn)品采用冷藏包裝。請(qǐng)?jiān)诘诌_(dá)-20°C時(shí)存放產(chǎn)品,。通過(guò)以等分試樣存儲(chǔ)來(lái)小化凍融循環(huán)的次數(shù),。對(duì)于日常使用，我們建議將等分試樣保持在4°C,。

參考

Chovancova,，P.，Merk，V.,，Marx,，A.，Leist,，M.,，Kranaster，R,。（2017）反向轉(zhuǎn)錄定量PCR直接來(lái)自沒(méi)有RNA提取且沒(méi)有等溫逆轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞：'零步'RT-qPCR協(xié)議,。Biol Methods Protoc（2017）2（1）：bpx008。doi：https：//doi.org/10.1093/biomethods/bpx008

Blatter,，N.,，Bergen，K.,，Nolte,，O.，Welte,，W.,，Diederichs，K.,，Mayer,，J.，Wieland,，M,。和Marx，A,。（2013）,，RNA的結(jié)構(gòu)和功能 - 閱讀耐熱DNA聚合酶。Angew,?；瘜W(xué)。詮釋,。Ed,。，52：11935-11939,。DOI：10.1002 / anie.20130665,。

Kranaster，R.,，Drum,，M.,，Engel,，N.,，Weidmann，M.,，Hufert,，F(xiàn)T和Marx，A,。（2010）,，一步RNA病原體檢測(cè)，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的突變熱穩(wěn)定Thermus aquaticus DNA聚合酶,。Biotechnology Journal,，5：224-231。DOI：10.1002 / biot.200900200,。

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